[发明专利]一种适用于流式细胞仪检测植物C值的细胞核的制备方法及应用

说明书

本发明提供了一种适用于流式细胞仪检测植物C值的细胞核的制备方法，属于涉及遗传学和基因组学技术领域，所述制备方法包括以下步骤：将新鲜植物叶片、解离液和钢珠混合，在25～40HZ的条件下研磨30～45S，静置，滤膜过滤，收集滤液得到细胞核；所述新鲜植物叶片的质量、解离液的体积和钢珠的数量比为0.015～0.025g:0.6～1.0mL:10～15个。本发明的方法能够快速、高效获得适用于流式细胞仪检测植物C值所需的完整细胞核，进而大大提高流式细胞仪检测植物C值和倍性的效率；本发明方法简便易行、高效可靠，适用于多种植物样本，植物材料所需用量相较于手切所需材料大大减少。

技术领域

本发明涉及遗传学和基因组学技术领域，尤其涉及一种适用于流式细胞仪检测植物C值的细胞核的制备方法及应用。

背景技术

自20世纪50年代开始，人们逐渐认识到不同生物体之间核DNA量会有很大的差异，并尝试解释这一现象，其中最有名的一个就是“C-值悖论”理论，即基因组大小与生物体的复杂性之间没有关联。C-值是判断一个物种基因组大小的基础数据，掌握了这些数据将有利于遗传学和基因组学研究方案的制定以及数据的分析。

生物体的单倍体基因组所含DNA总量称为C值，它代表了生物体基因组的大小，是生物体的一个重要特征。流式细胞术(flow cytometry，FCM)是应用流式细胞仪对处于液流状态中的荧光标记的微粒进行分析、分选并进行快速准确定性、定量测定与分析的技术，在植物学研究中，FCM主要用于检测植物细胞核DNA含量及其倍性分析。用流式细胞仪检测细胞DNA含量，通常采用特异的荧光染料对其进行染色，荧光分子结合DNA的量与细胞内的DNA含量呈正比，通过检测被激发的染色细胞发射的荧光强度可得到被测细胞的DNA含量，经过与已知基因组大小的内标进行比较，可获得被测植物的基因组大小。

植物细胞的细胞壁不仅使细胞性状不规格，而且自身还有荧光性，这样就扰乱了进样液流，不能很好的检测分离植物细胞。直接对植物原生质体染色，得出的荧光峰图不能准确反映核DNA含量，因为植物细胞质具有荧光性，同时质膜具有低渗透性。因此需要游离出完整的细胞核。目前，游离细胞核通用方法是用刀片将组织切碎，利用解离液的渗透作用释放出细胞核，这种方法存在效率低、费时、费力等缺陷，是实现流式细胞仪批量检测植物C值过程中的制约因素。随着植物基因组学的发展，应用流式细胞仪批量检测植物C值的需求越来越普遍，因此建立一种快速、高效获得适用于流式细胞仪检测植物C值所需的细胞核的制备方法可大大改进流式细胞仪检测植物C值的效率。

发明内容

本发明的目的在于提供一种适用于流式细胞仪检测植物C值的细胞核的制备方法及应用，该方法能够快速、高效获得适用于流式细胞仪检测植物C值所需的细胞核。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种适用于流式细胞仪检测植物C值的细胞核的制备方法，包括以下步骤：将新鲜植物叶片、解离液和钢珠混合，在25～40HZ的条件下研磨30～45S，静置，滤膜过滤，收集滤液得到细胞核；

所述新鲜植物叶片的质量、解离液的体积和钢珠的数量比为0.015～0.025g:0.6～1.0mL:10～15个；

所述钢珠的直径为0.15～0.25cm；

所述解离液包括以下浓度的组分：40～50mM MgCl₂·6H₂O，15～25mM MOPS，25～35mM柠檬酸钠，0.5％～1.5％质量体积浓度为0.5％～1.5％的PVP-40，体积浓度为0.1％～0.3％的Tritonx-100和8～12mM Na₂EDTA。

优选的，新鲜植物叶片的质量、解离液的体积和钢珠的数量比为0.02g:0.8mL:12。

优选的，所述研磨的频率为30HZ；所述研磨的时间为40S；所述研磨的温度为0～4℃。