[发明专利]一种基于衍生化的奶粉中4种人乳寡糖及其定性定量方法

说明书

本发明涉及一种基于衍生化的奶粉中4种人乳寡糖及其定性定量方法。其特征是：将奶粉样品进行前处理，然后用衍生化试剂对前处理后奶粉样品中的4种人乳寡糖进行衍生化，再经亲水作用色谱(HILIC)实现奶粉样品中目标人乳寡糖的同时分析。同时根据4种衍生化人乳寡糖衍生物在本分析体系下所绘制的标准曲线，得到奶粉中目标人乳寡糖的绝对含量信息。该方法具有选择性好，稳定性好，操作简便可控，时间短等特点，适用于奶粉和婴儿配方奶粉样品的快速、高通量分析。

技术领域

本发明涉及一种基于衍生化的奶粉中4种人乳寡糖及其定性定量方法。其特征是：将奶粉样品进行前处理，然后用衍生化试剂进行衍生化，再经亲水作用色谱(HILIC)实现奶粉样品中目标寡糖的同时分析。该方法具有选择性好，稳定性好，操作简便可控，时间短等特点，适用于奶粉和婴儿配方奶粉样品的快速、高通量分析。

技术背景

母乳是婴儿喂养的黄金标准。然而，由于母亲身体等因素的影响，部分婴儿无法进行母乳喂养，只有采用第二种婴儿喂养方式，即配方奶粉喂养。在母乳和配方奶粉喂养的诸多不同之处中，有一点是关于胃肠道菌群发育:母乳喂养的婴儿肠道菌群中双歧杆菌和乳酸菌较为丰富。众所周知，这两种细菌对宿主的健康都有潜在的好处。低聚糖是人乳中的第三大成分，对婴儿的正常生长发育起着至关重要的作用，如抗炎、抗感染、免疫调控和维持肠道菌群平衡，而低聚糖的缺乏很可能是造成这一差异的原因。

为了缩小这种差别，通常在配方奶粉中添加GOS和FOS，然而二者与天然存在的人乳寡糖结构差距较大，在过去一年左右的时间里，出现了一种新的以牛乳为基础的儿科配方，这些配方中添加与人乳中相同的低聚糖，如2’FL和LNnT，以帮助进一步缩小这一差距。除了解决这一差异的需求外，还需要更好地认识目前市售的婴儿配方奶粉中存在的主要的低聚糖浓度(3’SL和6’SL含量最高)，作为新配方的基础。因此，含有人乳寡糖的配方奶粉的开发和相应的质量控制要求合适的方法来准确测定人乳寡糖的含量。

我们发展一种简单、快速、高通量的法实现奶粉中的2'FL、LNnT、3’SL和6’SL的同时定量。由于奶粉中自身存在的3’SL和6’SL含量较低，因此我们采用荧光检测器分析酸性寡糖：3’SL和6’SL，紫外检测器分析中性寡糖：2'FL和LNnT，兼顾了人乳寡糖由于含量差异而难以同时定量的问题。

发明内容

本发明涉及一种基于衍生化的奶粉中4种人乳寡糖及其定性定量方法。本发明特征在于：将奶粉样品进行前处理，然后用衍生化试剂进行衍生化，再经亲水作用色谱(HILIC)实现奶粉样品中目标人乳寡糖的同时分析。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种基于衍生化的奶粉中目标寡糖的定量方法，将奶粉样品进行前处理，然后用衍生化试剂进行衍生化，再经亲水作用色谱(HILIC)实现奶粉样品中目标寡糖的同时分析，获得奶粉中目标人乳寡糖的含量信息。流动相为有机溶剂和水或有机溶剂和缓冲盐水溶液，通过优化色谱参数，使用等度或梯度洗脱条件。

1.所述前处理步骤为：取一定奶粉样品，加水和有机溶剂按一定比例溶解后配成1-2000mg/mL的样品溶液，加入1-5倍体积量的有机溶剂混匀，于0-10℃静置2-48小时后，0-10℃500-50000g离心不少于5分钟，取出上层清液，按照奶粉质量的1％-100％加入吸附材料进一步除去剩余蛋白以及其他低极性物质，涡旋震荡不少于5秒，然后0-10℃500-50000g离心不少于5分钟，收集上清液，离心1-5次后蒸干，得到奶粉中寡糖除蛋白样品；

2.衍生化包括：将前处理后的奶粉样品中加入衍生化试剂、氰基硼氢化钠、DMSO和冰醋酸溶液，在25-100℃的条件下反应15min-5h，反应结束后，于-10-10℃放置0.5-60分钟终止反应；

衍生化试剂为邻氨基苯甲酰胺，邻氨基苯甲酸，2-氨基吖啶酮等；

3.所述分析方法所采用的色谱柱固定相均为极性色谱填料，包括硅胶或极性键合硅胶填料，其结构式如下：