[发明专利]一种基于衍生化的奶粉中4种人乳寡糖及其定性定量方法

权利要求书

1.一种基于衍生化的奶粉中4种人乳寡糖的定量方法，其特征在于，具体的步骤如下：

(1)将奶粉样品进行前处理，然后用衍生化试剂对前处理后奶粉样品中的4种人乳寡糖进行衍生化；

(2)采用亲水作用色谱(HILIC)对步骤(1)中衍生化的人乳寡糖进行分离分析，记录色谱图和峰面积；

(3)将4种人乳寡糖标准品分别取3个以上不同质量依次进行步骤(1)中的衍生化和步骤(2)的分离分析，记录色谱图和峰面积，以峰面积Y对质量X(mg)进行线性回归计算，得衍生化人乳寡糖的线性回归方程或标准曲线，将步骤(2)得到的4种人乳寡糖峰面积分别代入它们对应的线性回归方程或标准曲线，得到奶粉样品中目标人乳寡糖的绝对含量信息；

4种人乳寡糖包括：

2’FL(2’-Fucosyllactose)：Fucα1-2Galβ1-4Glc

LNnT(Lacto-N-Neotetraose)：Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc

3’SL(3’-Sialyllactose)：Neu5Acα2-3Galβ1-4Glc

6’SL(6’-Sialyllactose)：Neu5Acα2-6Galβ1-4Glc。

2.按照权利要求1所述的定量方法，其特征在于，4种人乳寡糖包括：

2’FL(2’-Fucosyllactose)：Fucα1-2Galβ1-4Glc

LNnT(Lacto-N-Neotetraose)：Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc

3’SL(3’-Sialyllactose)：Neu5Acα2-3Galβ1-4Glc

6’SL(6’-Sialyllactose)：Neu5Acα2-6Galβ1-4Glc

以峰面积Y对质量X(mg)进行线性回归计算，

2’FL的线性回归方程为:Y＝70000X+52200,R²＝0.9991；

LNnT的线性回归方程为:Y＝30000X-1821.8,R²＝0.9999；

3’SL的线性回归方程为:Y＝29524X+884.67,R²＝0.9997，

6’SL的线性回归方程为:Y＝29742X+706.18,R²＝0.9998。

3.按照权利要求书1所述的定量方法，其特征在于，步骤(1)所述的前处理步骤为：取奶粉，加水和/或有机溶剂溶解后配成1-2000mg/mL的样品溶液，加入1-5倍体积量的有机溶剂混匀，于0-10℃静置2-48小时后，0-10℃ 500-50000g离心不少于5分钟，取出上层清液，按照奶粉质量的1％-100％加入吸附材料进一步除去剩余蛋白以及其他低极性物质，涡旋震荡不少于5秒，然后0-10℃ 500-50000g离心不少于5分钟，收集上清液，离心1-5次后蒸干，得到奶粉中寡糖除蛋白样品；所述有机溶剂是乙醇、丙酮、甲醇、乙腈、异丙醇、正丁醇中的一种或几种。

4.按照权利要求书1所述的定量方法，其特征在于，步骤(1)所述的衍生化过程包括：将前处理后的奶粉样品中加入衍生化试剂、氰基硼氢化钠、DMSO和冰醋酸溶液，在25-100℃的条件下反应15min-5h，反应结束后，于-10-10℃放置0.5-60分钟终止反应；衍生化试剂为邻氨基苯甲酰胺，邻氨基苯甲酸，2-氨基吖啶酮中的一种或二种或三种；

按照奶粉质量50-100mg计，前处理后，加入100-200μL的衍生化试剂(0.35-1mol/L)和氰基硼氢化钠(1-2mol/L)反应液，溶剂为DMSO：冰醋酸(V/V)＝50:50-70:30。

5.按照权利要求1所述的定量方法，其特征在于，步骤(2)所述的采用HILIC技术实现4种衍生化人乳寡糖分析的过程为：采用一步或/和多步亲水作用色谱进行分析；以水和有机溶剂，或缓冲盐水溶液和有机溶剂，水、缓冲盐水溶液和有机溶剂作为流动相，使用等度和/或梯度方法进行洗脱，检测。