[发明专利]苏氨酸醛缩酶、其编码基因和在屈昔多巴生物合成中的应用

说明书

本发明涉及L‑苏氨酸醛缩酶及其编码基因与应用，属于生物技术领域。所述L‑苏氨酸醛缩酶，为SEQ ID NO.1所示的蛋白，或将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加所获得的功能相同的蛋白。所述L‑苏氨酸醛缩酶能够以3‑/4‑位羟基取代的苯甲醛为底物，以5‑磷酸吡哆醛为辅酶，以甘氨酸为辅底物，在适当的条件和介质内进行酶催化反应，生物合成屈昔多巴(L‑threo‑DOPS)，该方法的非对映选择性能达到30％。本发明具有较高选择性的L‑苏氨酸醛缩酶对于屈昔多巴生物催化具有重要的意义。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及L-苏氨酸醛缩酶、其编码基因和在屈昔多巴生物合成中的应用。

背景技术

屈昔多巴(L-threo-DOPS)是一种新的抗帕金森氏病药物。用于改善由帕金森病引起的步态僵直和直立性头晕；改善由Shy-Drager综合征或家族性淀粉样神经病所致的直立性低血压、直立性头晕和昏厥；改善血液透析患者由于直立性低血压引发的头晕和乏力。

目前，屈昔多巴的合成方法主要包括化学合成和酶催化法。其中，化学合成法主要是通过加成反应，酯化反应和化学拆分来得到手性的屈昔多巴，虽然化学法操作简单，但是反应过程中用到了大量的水，重金属和剧毒的硫化氢，并且有大量的光学异构体作为副产物，不符合目前和将来国家提倡和推进的原子经济学和环境保护政策。而酶催化法具有条件温和，用水量少(仅为化学法的十分之一)，没有重金属污染，不使用剧毒化学品，手性选择高等诸多优点，具有很好的应用前景。

苏氨酸醛缩酶(Threonine Aldolase，TA)有着十分广泛的应用潜力，它可以催化合成手性的医药关键中间体β-羟基-α-氨基酸。根据苏氨酸醛缩酶对苏氨酸底物α碳上的立体专一性可将该酶分为L型和D型两类。但是由于苏氨酸醛缩酶的稳定性不好，手性选择性特别是β-羟基的手性选择性不足，限制了此酶在手性合成中的应用。因此非常有必要挖掘具有高选择性的苏氨酸醛缩酶用于屈昔多巴的合成。

发明内容

本发明利用宏基因组测序技术从四川黑熊保护及孵育基地的健康黑熊的粪便样品中分离出一种新的L-苏氨酸醛缩酶基因，命名为L-TA Sz-1-2基因，其核苷酸序列如序列表中序列2所示，自5’末端第1位到第1032位为开放阅读框，长1032bp，其编码的L-TA Sz-1-2蛋白的氨基酸如序列1所示，由343个氨基酸序列组成。

本发明的L-苏氨酸醛缩酶属于生物催化剂，能够以3-/4-位羟基取代的苯甲醛为底物，以5-磷酸吡哆醛为辅酶，以甘氨酸为辅底物，在适当的条件和介质内进行酶催化反应，用于生物合成屈昔多巴(L-threo-DOPS)，该方法的非对映选择性能达到30％。由于目前屈昔多巴主要采用环境不友好，条件严苛的化学合成，酶催化由于较低的de值尚未实现工业化生产，所以本发明的L-苏氨酸醛缩酶对于屈昔多巴生物催化具有重要的意义。

一方面，本发明提供一种L-苏氨酸醛缩酶，为如下a1或a2所示：

a1.SEQ ID NO.1所示的蛋白；

a2.将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加所获得的功能相同的蛋白。

本发明还提供所述L-苏氨酸醛缩酶的编码基因。优选，所述编码基因为如下b1-b3中的任一种：

b1.SEQ ID NO.2所示的DNA分子；

b2.在严格条件下与b1限定的DNA分子杂交且编码所述L-苏氨酸醛缩酶的DNA分子；

b3.与b1或b2限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述L-苏氨酸醛缩酶的DNA分子。