[发明专利]猪传染性胃肠炎病毒PLA检测试剂盒

说明书

本发明涉及一种猪传染性胃肠炎病毒PLA检测试剂盒。所述试剂盒包括(1)两株生物素标记的抗体：抗TGEV抗体1A2、抗TGEV抗体2B1；(2)探针；(3)连接液；(4)PCR mix：Universal PCR Assay、2×Fast Master Mix。将两株生物素标记的针对猪传染性胃肠炎病毒SA蛋白的特异性单克隆抗体稀释到工作浓度、与探针孵育进行连接，最后采用实时定量PCR扩增目的单链DNA，成功检测到猪传染性胃肠炎病毒。本发明解决了现有技术时间长、工作量大、灵敏度低、非特异性、操作复杂等缺陷；具有不涉及放射性物质，试剂与样品消耗量小，灵敏度高，无需特殊设备，操作简单的优点。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种用邻位连接技术(PLA)快速检测猪传染性胃肠炎病毒的试剂盒。

背景技术

猪传染性胃肠炎(Transmissible gastroenteritis of swine，TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus of swine，TGEV)引起的一种以严重呕吐和脱水为特征的高度接触性传染病。不同年龄和品种的猪对本病均易感，其中两周龄以内的仔猪致死率可达100％。TGE首次1946年由Doyle和Hutchings在美国报道，日本(1956年)和英国(1957年)先后报道该病，在此之后欧洲、北美、亚洲等多个国家相继报道有TGE的发生。我国从上个世纪50年代末期就有TGE的报道，近些年来该病在我国的流行呈明显上升趋势，尤其是冬季和早春寒冷季节常呈地方流行性，给养猪业造成极大危害。

本病的潜伏期很短，一般为12-18小时，仔猪发病后往往表现为严重脱水而死亡。而周龄较大或成年猪虽然死亡率极低，但是出现掉膘、降低饲料报酬，以致浪费药物和人力等，给养猪业造成巨大经济损失。因此，早发现、早治疗对预防控制本病十分重要。

TGEV的隐性感染以及与它致病原的混合感染均普遍存在，增加了TGEV临床诊断的难度，目前对TGEV感染的确诊主要依靠实验室诊断技术，包括病毒的分离与鉴定、IPMA、IFA、基因芯片、RT-LAMP、胶体金、RT-PCR、ELSA，但病毒分离鉴定、IPMA、IFA、基因芯片方法均存在试验条件要求高、操作复杂、过程繁琐、费用成本高等条件限制，不利于基层实验室快速检测。RT-LAMP和胶体金方法对仪器设备要求较低，但敏感性太高，易导致假阳性，RT-PCR操作简单，但不能定量，荧光RT-PCR方法弥补了常规RT-PCR不能定量等问题，但对仪器、试剂、操作人员技术水平要求均较高。

邻位连接(Proximity Ligation Assay，PLA)技术作为一项新的蛋白质分析工具，具有特异性强、灵敏度高、简便、快速等优点，其特点采用单克隆抗体-核酸复合物作为邻位连接探针(proximity probes)，当一对邻位探针同时识别同一个目标蛋白分子时，它们将在空间位置上相互临近，通过连接反应形成一段可扩增的DNA标签序列，该标签序列能够反映待测蛋白的种类及浓度。该技术将对蛋白质的检测转变为对DNA核酸序列的检测，实现了特殊蛋白质的检测、定量及定位。仪器常见、所需样品量少，操作简单。

发明内容

本发明的目的在于克服其他检测方法的缺陷，研制一种猪传染性胃肠炎病毒PLA检测试剂盒及其检测方法。

本发明的技术方案是：一种猪传染性胃肠炎病毒PLA检测试剂盒，包括以下成分：

(1)生物素标记的抗体：生物素标记抗TGEV抗体1A2、生物素标记抗TGEV抗体2B1；所述抗TGEV抗体1A2是由分泌抗猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体细胞株TGEV－SA-1A2-(1-10)CGMCC No.18315分泌；所述抗TGEV抗体2B1是由分泌抗猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体细胞株TGEV－SA-2B1-(1-10)CGMCC No.18314分泌；

(2)探针：200nM 3’Prox-Oligo、200nM 5’Prox-Oligo、探针稀释缓冲液、抗体稀释缓冲液；