[发明专利]一种脐带间充质干细胞分离培养扩增方法

说明书

本发明公开了一种脐带间充质干细胞分离培养扩增方法，1)清理，2)处理，3)培养，4)接种传代，本发明采用的组织块分离法获得的脐带间充质干细胞方法简单，成本低，细胞活性好，纯度高，最终收获细胞浓度高，获得的间充质干细胞方法简单，能快速高效分离MSC，培养时间缩短，培养第4～5天即可看到细胞从组织块爬出，最终收获细胞浓度高，整个脐带间充质干细胞培养工艺能够标准化、程序化、规范化。

技术领域

本发明涉及干细胞分离培养技术领域，尤其涉及一种脐带间充质干细胞分离培养扩增方法。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)是具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的细胞群体，是动物有机体和各种组织器官的起源细胞。新近的研究表明，众多成体组织中(如骨髓、肌肉、胃肠道、皮肤、视网膜、外周及中枢神经系统等)均存在间充质干细胞。MSCs它来源广泛、易体外分离扩增，具有向三种胚层细胞分化的多向分化潜能；具有低免疫原性、不能刺激产生同种异体免疫反应、不被细胞毒性T细胞和NK细胞杀伤，“归巢”修复作用，肿瘤趋向性以及免疫调节作用。

研究表明，脐带间充质细胞主要来源于脐带华通氏胶(Wharton’S jelly)。UC-MSCs的优势在于：①脐带为分娩后的废弃物，取材方便，来源广泛，易于收集、保存、冷冻、不受伦理、道德及法律方面的争论与限制；②相对纯净，与干细胞输注相关的病毒和病原微生物感染率远低于骨髓移植；③人UC-MSCs含量丰富，较为原始，分化能力强，可在体外进行分离、培养，扩增迅速，且生物性能稳定，多次传代扩增仍能保持旺盛功能，可以为实验和临床提供充足的细胞来源；④人UC-MSCs不表达或低表达组织相容性标记，免疫原性低，异体移植无免疫排斥反应或反应较弱，不须经过严格配型即能使用，适宜于不同个体之间的移植；⑤UC-MSCs可直接获取于新生儿脐带，进行储存库长期保存，不存在对机体产生创伤。因此UC-MSCs已被当做是临床和科研工作中MSCs的一个更佳来源。

人脐带组织中富含华通氏胶，如何高效地将华通氏胶中的脐带间充质干细胞分离出来是目前主要研究的难点，也是制约后期临床应用和产业化的关键技术。脐带间充质干细胞原代分离制备最常见分离方法主要为酶消化法和组织块贴壁培养法。

酶消化分离的经济成本高，消化时间长，一般需要4～6个小时，最长的有消化16小时，组织块大小同时也会影响细胞的消化效果，如消化不充分，无法得到足够数量的细胞，而消化时间过长，其消化酶对细胞的损伤太大，细胞会大量死亡。因为脐带主要富含华通氏胶，消化后的液体非常粘稠，离心后不宜分离出细胞。常规的组织块培养法原代培养时间较长，需要14-20d，主要为组织块大小和贴壁影响其分离效率。

发明内容

本发明的提供一种脐带间充质干细胞分离培养扩增方法。

本发明的方案是：

一种脐带间充质干细胞分离培养扩增方法，包括下列步骤：

1)清理，无菌条件下，获取新鲜脐带，将新鲜脐带用清洗液冲洗脐带表面，清洗去除脐带上的血管残留的血液与其他杂物；

2)处理，将清洗后的脐带用手术刀去除脐静脉与脐带表面的羊膜层，然后将脐带剪成细条状，再将细条状脐带剪碎为1～3mm³的脐带组织块；此操作方法较简单，节约时间，仅剩脐带为Wharton’s胶，Wharton’s胶为脐带间充质干细胞的主要来源；

3)培养，将所述脐带组织块平铺于细胞培养皿中，将水分挥发后加入含有10～20％胎牛血清的培养液中进行培养；此操作的特点是组织块小，组织贴壁牢固，有利于脐带间充质干细胞从组织块中爬出，也能获得更多原代细胞；