[发明专利]一种脐带间充质干细胞分离培养扩增方法

权利要求书

1.一种脐带间充质干细胞分离培养扩增方法，其特征在于，包括下列步骤：

1)清理，无菌条件下，获取新鲜脐带，将新鲜脐带用清洗液冲洗脐带表面，清洗去除脐带上的血管残留的血液与其他杂物；

2)处理，将清洗后的脐带用手术刀去除脐静脉与脐带表面的羊膜层，然后将脐带剪成细条状，再将细条状脐带剪碎为1～3mm³的脐带组织块；

3)培养，将所述脐带组织块平铺于细胞培养皿中，将水分挥发后加入含有10～20％胎牛血清的培养液中进行培养；

4)接种传代，所述脐带组织块原代分离培养脐带间充质干细胞生长达到80～90％融合后，即可传代扩增培养，获得脐带间充质干细胞，用0.0625％胰酶/EDTA消化细胞，按3000～5000个/cm²接种，所述脐带间充质干细胞接种后4～5天可以达到95％融合，融合95％以上所述脐带间充质干细胞可以扩增至25代次以上。

2.如权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞分离培养扩增方法，其特征在于：所述步骤1)中清洗液含青霉素、链霉素的磷酸盐缓冲液。

3.如权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞分离培养扩增方法，其特征在于：步骤3)中所述10～20％胎牛血清的培养液中含有含核糖核苷的α-MEM基础培养液与胎牛血清。

4.如权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞分离培养扩增方法，其特征在于：还包括步骤5)将步骤4)中获得的间充质干细胞进行质量评估，所述质量评估包括细胞数量、细胞活性、细胞表面标记物、分化功能、无菌检测、支原体检测、安全性评估。

5.如权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞分离培养扩增方法，其特征在于：所述步骤3)中细胞培养皿中细胞培养3天换一次10～20％胎牛血清的培养液，之后每间隔2～3天更换10～20％胎牛血清的培养液，贴壁4～5天后即可见脐带间充质干细胞从所述脐带组织块中爬出，7～10天后脐带间充质干细胞可以达到80～90％融合。

6.如权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞分离培养扩增方法，其特征在于：所述步骤3)中加入20～50ml/皿的含有10～20％胎牛血清的培养液。

7.一种用于建立了脐带间充质干细胞生产规范、质量控制体系及评估体系，其特征在于：采用如权利要求1所述的脐带间充质干细胞分离培养扩增方法。