[发明专利]一种高产红景天苷和/或酪醇的工程菌及其应用

权利要求书

1.一种高产红景天苷的工程菌，其特征在于：它是将酿酒酵母菌中的ARO4基因编码第229位氨基酸的密码子突变为编码亮氨酸的密码子、ARO7基因第141位甘氨酸的密码子突变为编码丝氨酸的密码子、ARO3基因第222位赖氨酸的密码子突变为编码亮氨酸的密码子的重组酵母菌；ARO4/ARO7/ARO3基因来源的酿酒酵母菌株不限于S288C和/或CEN.PK菌株；

所述ARO4基因第229位的密码子为TTG，所述ARO7基因第141位的密码子为AGT；第222位的密码子为CTA；

所述重组酵母菌中，基因pHA2失活；基因pHA2突变为SEQ ID No.6所示的序列；

所述重组酵母菌中包含携带RrU8GT33的严谨性质粒PRS413质粒；所述重组酵母菌中还包含携带ARO10、ARO2和/或ARO1的整合型pRS425质粒；

所述重组酵母菌中还包含携带RKI1、TKL1的整合型pRS425质粒；

所述重组酵母菌还包括突变后的ARO4、ARO7、ARO3的表达片段扩增、串联后获得的串联片段ARO4p-ARO4-ARO4t- ARO7p-ARO7-ARO7t- ARO3p-ARO3-ARO3t；

所述突变后的ARO4、ARO7、ARO3分别为ARO4^K229L、ARO7^G141S和ARO3^K222L；

所述串联片段重组到酵母基因组的308a位置；

所述重组酵母菌的基因pdc1失活。

2.根据权利要求1所述的工程菌在生产红景天苷和/或酪醇中的应用。

3.一种制备红景天苷的方法，其特征在于：它是采用如权利要求1所述的工程菌发酵制备。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：它包括如下步骤：(1)取如权利要求1所述的工程菌，培养，得到酿酒酵母种子液；(2)将酿酒酵母种子液接种到发酵培养基中，发酵，得发酵液；(3)分离纯化。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(1)的工艺为：取工程菌，接种到SC液体培养基中，28～32℃、100～300rpm摇床培养12～36h。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，发酵的条件为：将酿酒酵母种子液接种到发酵培养基中后，OD600为0.1～0.3；发酵的温度为28～32℃，搅动速度100～300rpm；控制pH为5.3～5.8；空气流速为2～6L/min；发酵时间为120～170h；和/或，步骤(2)中，所述发酵培养基为SC培养基，在发酵的过程中连续添加葡萄糖溶液，保持发酵培养基中葡萄糖浓度为10-20g/L和/或，步骤(3)中，所述分离纯化方法为柱层析方法。

7.根据权利要求6所述的方法其特征在于：所述柱层析方法为：将发酵液用HP20大孔吸附树脂吸附，后用清水洗涤树脂，再依次用40％乙醇、70％乙醇洗脱，得红景天苷的纯品。

8.一种制备红景天苷和/或酪醇的方法，其特征在于：它是采用如权利要求1所述的工程菌发酵制备；

包括如下步骤：

（1）取如权利要求1所述的工程菌，培养，得到酿酒酵母种子液；

（2）将酿酒酵母种子液接种到发酵培养基中，发酵，得发酵液；

（3）分离纯化；

步骤（1）的工艺为：取工程菌，接种到SC液体培养基或YPAD培养基中，28~32℃、100~300rpm摇床培养12~36h；

步骤（2）中，发酵的条件为：将酿酒酵母种子液接种到发酵培养基中后，OD600为0.4~0.9；发酵的温度为28~32℃，搅动速度300~600 rpm；控制pH为5.3~5.8；空气流速为2.5 vvm~3.5 vvm；发酵时间为120~170h；

和/或，步骤（2）中，所述发酵培养基为SC培养基或YPAD培养基，在发酵的过程中连续添加葡萄糖溶液，保持发酵培养基中葡萄糖浓度为0.5~5 g/L和/或，步骤（3）中，所述分离纯化方法为柱层析方法；

所述柱层析方法为：将发酵液用HP20大孔吸附树脂吸附，后用清水洗涤树脂，再依次用40%乙醇、70%乙醇洗脱，得红景天苷的纯品。