[发明专利]一种提高猪圆环病毒增殖的方法

说明书

本发明公开了一种提高猪圆环病毒增殖的方法。本发明提供了一种提高猪圆环病毒增殖的方法，包括如下步骤：A1)降低宿主细胞中RBP4蛋白的表达和/或活性；A2)用A1)处理过的所述宿主细胞繁殖猪圆环病毒。本发明制备了一种敲除宿主RBP4基因的PK‑15细胞系，该细胞基因编辑技术对宿主基因RBP4进行特异性的敲除。将宿主基因RBP4敲除后筛选单克隆细胞接种猪圆环病毒，能显著提高猪圆环病毒的拷贝数，从而提高了用细胞培养猪圆环病毒所收获的病毒滴度，能有效解决实验室生产猪圆环病毒滴度较低的问题。

技术领域

本发明涉及基因工程领域和病毒领域，具体涉及一种提高猪圆环病毒增殖的方法。

背景技术

视黄醇结合蛋白4(Retinol binding protein 4，RBP4)是新发现的一种细胞因子，属于视黄醇结合蛋白家族成员，主要由肝脏和脂肪组织分泌。RBP4主要负责视黄醇的储存、吸收，并将视黄醇及其活性代谢产物从肝脏运输到靶组织，在辅助视黄醇发挥生理功能过程中发挥重要作用。已有研究表明，RBP4与胰岛素抵抗、II型糖尿病密切相关，参与慢性炎症、代谢综合征病理生理过程。在免疫细胞中，血清中RBP4水平升高会激活脂肪组织巨噬细胞和树突状细胞，提高细胞因子分泌，从而导致炎症和胰岛素抵抗，能够活化CD4⁺T细胞，提高其增殖和分化。最新的研究还发现，RBP4还与乙肝病毒的复制密切相关。

猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)在分类学上属圆环病毒科圆环病毒属，为目前已知的最小的动物病毒之一。其中II型圆环病毒(PCV2)感染可以导致猪发生断奶仔猪多系统衰竭综合征、猪皮炎肾病综合征、猪呼吸系统混合疾病、繁殖障碍综合征等猪圆环病毒病(Porcine circovirus diseases,PCVD)。我国自2000年报道猪群中存在PCV2感染以来，流行范围迅速波及至全国，给养猪业造成了巨大的经济损失。PCV2主要感染宿主免疫细胞，可导致机体发生免疫抑制，增强机体对其它病原体的易感性。临床上，PCV2与其他病毒或细菌的混合感染十分常见，使得疾病复杂化，难以治愈。随着猪场的规模化、集约化发展，由PCV2及其混合感染引起的疾病造成的损失越来越大，已成危害养猪业重大疫病之一。疫苗免疫是预防和控制PCVD的最为经济和有效的方式，目前市场上PCV2疫苗主要种类有灭活疫苗和基因工程疫苗等。然而，PCV2病毒在普通工程细胞上复制能力弱的特点是获得高滴度病毒用于制备高效价PCV2疫苗的关键瓶颈之一。因此，显著提高PCV2病毒产量是制备高效价PCV2疫苗的重要手段。

发明内容

本发明的目的是提供一种能用于提高猪圆环病毒增殖的方法，能够克服目前实验室生产中猪圆环病毒滴度不高的问题，从而弥补现有技术的不足。

第一方面，本发明要求保护一种提高猪圆环病毒增殖的方法。

本发明所要求保护的提高猪圆环病毒增殖的方法，可包括如下步骤：

(A1)降低(如缺失)宿主细胞中视黄醇结合蛋白4(RBP4)的表达和/或活性；

(A2)用(A1)处理过的所述宿主细胞繁殖猪圆环病毒。

在本发明的具体实施方式中，所述宿主细胞具体为PK-15细胞；所述猪圆环病毒具体为II型猪圆环病毒(PCV2)。

进一步地，步骤(A1)中，所述降低宿主细胞中RBP4蛋白的表达和/或活性可为敲除所述宿主细胞中RBP4蛋白的编码基因。

更进一步地，所述“敲除所述宿主细胞中RBP4蛋白的编码基因”可通过序列特异性的基因编辑技术对所述编码基因进行特异性剪切来实现。

其中，所述序列特异性的基因编辑技术可为CRISPR/Cas9基因编辑技术。