[发明专利]一种环状RNA快速鉴定方法

说明书

本发明涉及生物医药领域，具有涉及一种环状RNA快速鉴定方法。本发明目的是在于提供一种使用便捷、可靠性高、经济实惠的环状RNA快速鉴定方法，该方法包括以下步骤：提取总RNA并采用随机引物法合成cDNA；设计并合成三对引物，所述引物包括：针对成环区反向设计的环状RNA引物、针对线性区对向设计线性RNA引物以及针对成环区对向设计的综合RNA引物，利用所述引物进行PCR反应，结合PCR结果进行定量分析可判断该位点是否形成了环状RNA；本发明方法适用于用于鉴定临床疾病环状RNA标志物，也可用于开发试剂盒开展环状RNA的科学研究，相对于现有技术而言，本发明方法可以实现环状RNA的快速鉴定，降低成本的同时减少操作步骤。

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种环状RNA快速鉴定方法。

背景技术

环状RNA(circRNA)是一类不具有5'末端帽子和3'末端poly(A)尾巴、并以共价键形成环形结构的非编码单链RNA分子，广泛存在于多种生物细胞中,具有结构稳定、序列保守及细胞或组织特异性表达等特征。目前研究表明,circRNA可通过多种途径发挥作用，例如充当miRNA海绵与miRNA相作用、参与调节基因的转录、细胞周期或衰老等生理过程,还与人类健康杀手如癌症和心脏病等多种疾病的调控过程密切相关,具有重要的研究价值和应用价值。

现有技术中对于环状RNA的鉴定，一般分为初筛和确认两个阶段，在初筛阶段，目前通用方法是设计反向引物鉴定环状RNA，并设计对向引物鉴定对应的mRNA，然后通过RNA消化酶Rnase R消化，再次利用反向引物和对向引物鉴定，综合两次结果进行判断。初筛认为确实存在环状RNA的，再通过PCR产物测序或RNA探针进行确认。现行初筛方案需要两轮鉴定，而且中间需要进行Rnase R消化操作。一方面，操作耗时；另一方面，Rnase R价格昂贵，导致该方法成本高昂。

发明内容

针对现有技术的缺陷，本发明提供了一种环状RNA快速鉴定方法，第一方面，无需使用Rnase R等昂贵试剂，能够显著降低实验成本，另一方面，相对于常用技术手段，本发明避免了RNA酶消化步骤，不需要再进行第二次逆转录PCR实验，便于简化实验操作，除此之外，对结果进行综合分析初筛后，通过测序等手段可进一步确认新的环状RNA分子，有助于发现新的环状RNA。

为达到上述目的，本发明提供的一种环状RNA快速鉴定方法，包括以下步骤：(1)提取总RNA，所述总RNA包括环状RNA和线性

mRNA；

(2)采用随机引物法合成cDNA。

(3)预测成环位点，针对所述成环位点设计并合成三对不同引物；

(4)分别采用三对不同引物对所述cDNA进行PCR扩增，区别于现有技术中需要通过RNase R处理消化线性mRNA、二次检测环状RNA的步骤，降低实验成本且减少操作步骤；

(5)对PCR扩增结果进行定量分析并判断是否形成环状RNA，RNA的相对含量为其相对内参分子的含量，其中，若环状RNA相对含量与线性RNA相对含量两者之和小于总RNA相对含量，说明该成环位点，不止形成拟鉴定的环状RNA，还有其他环状RNA，可通过对环状RNA引物的PCR产物进行分离，并通过测序进一步鉴定其他环状RNA；若环状RNA相对含量与线性RNA相对含量两者之和等于总RNA相对含量，则说明该成环位点形成了拟鉴定的环状RNA，并且所设计引物特异性非常好；若环状RNA相对含量与线性RNA相对含量两者之和大于总RNA相对含量，则说明该RNA分子，除了形成拟鉴定的环状RNA分子外，还形成了其他成环位点不在设计位点的环状RNA分子，且另外形成的环状RNA分子的成环区包含线性RNA引物设计区域，需要进一步验证。

进一步地，步骤(3)中所述引物包括：

环状RNA引物，针对成环区反向设计，用于扩增环状RNA；