[发明专利]枯草芽孢杆菌CRISPR-Cas9基因组编辑系统

说明书

本发明公开了枯草芽孢杆菌CRISPR‑Cas9基因组编辑系统，该系统的构建方法为：1)构建质粒pBSCas9；2)构建质粒pDonor；3)构建构建多位点gRNA表达过程中辅助质粒pHG；4)由pBSCas9，pDonor和pHG组成枯草芽孢杆菌CRISPR‑Cas9基因组编辑系统。本发明解决了目前枯草芽孢杆菌传统基因组编辑技术中存在的问题，不引入任何“负筛选”标记，构建了高效率、高精确度的CRISPR‑Cas9和CRISPR‑Cas9n基因组无痕编辑系统。且可实现单位点和多位点等不同类型的基因编辑操作，同时实现编辑流程的迭代编辑循环。

技术领域

本发明属于基因组编辑技术领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌CRISPR-Cas9和CRISPR-Cas9n基因组编辑系统及构建方法及用途。

背景技术

枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)是存在于土壤和植物微生态系统中的优势微生物种，广泛存在于自然界。无致病性，对人畜无害，不污染环境，具有很强的抗逆能力和抗菌防病作用，被广泛用为分子生物学研究模式生物以及工业化生产高产菌株宿主。

随着系统生物学的发展和开发微生物细胞工厂的需要，高效的基因组“无痕”编辑技术是代谢网络调控研究中的研究热点。枯草芽孢杆菌中传统的无痕基因组编辑系统主要依赖“负筛选”方法，不仅编辑效率较低、精确度低、而且无法满足多位点修饰的需要。近年来，已有CRISPR系统在微生物基因组编辑方面的报道，但目前在枯草芽孢杆菌的CRISPR基因编辑报道中，并未实现流程化的迭代循环系统，且未实现多位点的同时编辑。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供枯草芽孢杆菌CRISPR-Cas9基因组编辑系统。

本发明的第二个目的是提供枯草芽孢杆菌CRISPR-Cas9基因组编辑系统的构建方法。

本发明的第三个目的是提供枯草芽孢杆菌CRISPR-Cas9基因组编辑系统对对枯草芽孢杆菌基因组进行基因编辑的用途。

本发明的第四个目的是提供枯草芽孢杆菌CRISPR-Cas9n基因组编辑系统。

本发明的第五个目的是提供枯草芽孢杆菌CRISPR-Cas9n基因组编辑系统的构建方法。

本发明的第六个目的是提供枯草芽孢杆菌CRISPR-Cas9n基因组编辑系统对对枯草芽孢杆菌基因组进行基因编辑的用途。

本发明的技术方案概述如下：

枯草芽孢杆菌CRISPR-Cas9基因组编辑系统的构建方法，包括如下步骤:

1)由来源于质粒pCas9cur的Cas9基因，来源于质粒pHP13的氯霉素抗性基因及其启动子(Cm)，质粒pEBS-cop1的复制子(repF)，质粒pUC18的复制子(ColE1)，枯草芽孢杆菌启动子P43和质粒pAX01上的木糖启动子及诱导元件(xylAcassette)构建质粒pBSCas9；所述Cas9基因核苷酸序列如SEQ ID NO.34所示；氯霉素抗性基因及其启动子(Cm)的核苷酸序列如SEQ ID NO.35所示；质粒pEBS-cop1的复制子(repF)的核苷酸序列如SEQ ID NO.37所示；质粒pUC18的复制子(ColE1)的核苷酸序列如SEQ ID NO.38所示；枯草芽孢杆菌启动子P43的核苷酸序列如SEQ ID NO.31所示；质粒pAX01上的木糖启动子及诱导元件(xylAcassette)的核苷酸序列如SEQ ID NO.40所示；所述质粒pBSCas9的核苷酸序列如SEQ IDNO.27所示；

2)以pHP13为出发质粒，添加枯草芽孢杆菌启动子Pmanp和靶向复制子rep60的gRNA(gRNA-rep60)，并将原氯霉素抗性基因及启动子序列替换为来源于质粒pGRB的氨苄青霉素抗性基因及启动子序列(Amp)构建质粒pDonor；