[发明专利]抗菌肽NZX的制备方法及应用

说明书

本发明提供抗菌肽NZX的制备方法及应用。本发明通过优化抗菌肽NZX基因序列，首次实现了抗菌肽NZX在毕赤酵母中的高效表达，产量突破克级水平，克服了大规模生产中产量过低或化学合成成本过高的问题，并建立完善的纯化体系，可实现规模化生产。此外，抗菌实验结果表明，本发明的抗菌肽NZX对革兰氏阳性菌，具有显著抑菌活性，同时具有低细胞毒性、低溶血性的特点，可应用于抗菌药物开发，饲料添加剂开发等领域，具有广阔的应用价值和市场前景。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及抗菌肽NZX的制备方法及应用。

背景技术

抗菌肽(AMPs)是多细胞生物为保护宿主免受病原微生物侵害而产生的内源性多肽，由于它们在构成先天性免疫系统中起着至关重要的作用，因此抗菌肽(AMPs)也被定义为宿主防御肽。目前研究最多的抗菌肽(AMPs)一般带正电荷，具有阳离子特性，可以与带负电的细菌膜相结合，导致脂质双侧结构的解体(Min-Duk Seo等，2012)。大多数抗菌肽(AMPs)同时具有亲水性和疏水性两种结构域，这种结构可以使抗菌肽(AMPs)能够与脂质组分(疏水区)和磷脂组分(亲水区)相结合(Jenssen等，2006)。抗菌肽(AMPs)对多种微生物具有广谱抗菌活性，包括革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌和病毒(Zasloff等，2002)。由于抗菌肽具有抗菌活性好，抗菌谱广(包括耐药性细菌)，多种抗菌机制，耐药性出现的可能性较低，因此成为新型抗生素替代品的有力候选(Ali Adem Bahar等，2013)。

Plectasin是2005年Mygid等人从来源于北欧松林地表腐生子囊菌(Pseudoplectania nigrella)中分离得到一种具有抗菌功能的抗菌肽，也是首例真菌防御素，具有高效抗G⁺菌活性抗菌肽。Plectasin基因开放阅读框编码一个95个残基长的前体肽，其1～23是信号肽序列，24～55位为前导肽序列，56～95位为成熟肽(Plectasin)序列。Plectasin成熟多肽由40个氨基酸组成，含有6个Cys残基和5个Lys残基，一个区别的四肽(DEDD)模式，分子量为4407.99Da，净电荷在+1到+3之间变化，主要取决于它的两个组氨酸的离子状态。其6个Cys在分子内形3对二硫键(Cys4-Cys30，Cys15-Cys37，Cys19-Cys39)，二级结构由3对二硫键稳定的一个N端α-螺旋和C端的两个反向平行的β-折叠结构以及螺旋和折叠结构之间的Loop区组成。Plectasin对革兰氏阳性细菌具有明显杀伤作用。Mygind等研究了Plectasin对130余株不同来源肺炎链球菌的抑制作用，发现对于青霉素敏感或抗性菌株，最小杀菌浓度(MIC)均在0.1-8μg/mL之间，MIC₅₀为1μg/mL(Mygind,Fischer等，2005)。

NZX是一种新型的Plectasin衍生肽，它是第一个经证实对肺炎链球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌同时具有活性的真菌防御素类抗菌肽NZX，可以在体外有效杀死结核分枝杆菌，其浓度与标准的抗结核分枝杆菌药物相当。此外，NZX不容易被蛋白酶降解，当浓度高达100μM时没有细胞毒性。在小鼠结核分枝杆菌感染模型中，NZX治疗的小鼠肺在5天后细菌负荷量降低46％，治疗效果与抗结核分枝杆菌药物利福平几乎没有差异，这进一步支持了NZX作为未来可能治疗结核病的候选药物。目前，尚未见利用基因工程方法生产抗菌肽NZX的相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供抗菌肽NZX的制备方法及新用途。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供抗菌肽NZX在制备抗菌药物或组合物中的应用，其中，所述菌包括但不限于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和猪葡萄球菌(Staphylococcus hyicus)。

本发明中，所述抗菌肽NZX的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

第二方面，本发明提供一种重组表达载体，所述重组表达载体携带如下基因表达框：