[发明专利]非诊断目的基于poly(A)加尾及生物循环发光技术超灵敏检测miRNA的方法

说明书

本发明属于miRNA检测领域，具体涉及一种非诊断目的基于poly(A)加尾及生物循环发光技术超灵敏检测miRNA的方法，包括下述步骤：1)高特异性的磁球探针的制备；2)磁球探针结合分离目标miRNA；3)poly(A)加尾放大信号；4)生物循环发光信号放大。本申请能够实现样品中miRNA的高效特异性检测，通过分子茎环探针与磁球的协同作用，可以从待测样品中高特异性的分离出待检miRNA，实现高特异性检测。

技术领域

本发明属于miRNA检测领域，具体涉及一种非诊断目的基于poly(A)加尾及生物循环发光技术超灵敏检测miRNA的方法。

背景技术

微小RNA (miRNA)是一类内源性非编码RNA小分子，广泛存在于真核生物中，参与细胞的发育、分化、增殖与凋亡等生物学过程。作为基因表达的调控者，通过与其靶基因3端非翻译区不完全匹配结合进而抑制靶基因翻译，并调控着机体内三分之一以上基因的表达。最近的研究表明，miRNA的显着异常表达与各种疾病，特别是人类肿瘤、病毒感染、神经退行性疾病密切相关。因此miRNA的早期检测和辅助诊断已经成为现今的研究热点。

Poly(A)通常是指位于mRNA上的150-200个腺嘌呤核糖核苷酸碱基残基，由于此发现，人们研究重组了一种poly(A)聚合酶，poly(A)聚合酶是通过ATP转化的AMP在RNA 3’尾巴端添加一段长的腺嘌呤核糖核苷酸碱基序列，本反应不依赖于模板的存在。Poly(A)聚合酶加尾技术，除了能提供更多的miRNA检测方法外，还能提高miRNA的稳定性，保护其降解，提高检测的重复性。ATP生物发光技术因其无需外界光源刺激、不需要培养、操作简便、重现性好、快速完成检测等特点广泛的应用。AMP和ATP之间通过酶和辅料的作用可以实现AMP-ADP-ATP的转换，结合荧光素酶检测体系后实现ATP的循环检测。所以本发明拟结合使用纳米磁珠结合分子茎环探针技术，特异性的将目标miRNA从复杂基质中分离出来，通过poly(A)聚合酶，对miRNA进行加尾，同时提供了更多可用于检测的腺嘌呤核糖核苷酸碱基，经过核酸外切酶T的作用切割成AMP，用于生物循环发光检测，实现信号的级联放大效应，制备一种基于polya加尾及生物循环发光技术超灵敏检测miRNA试剂盒。

发明内容

本发明的目的在于提供一种非诊断目的基于poly(A)加尾及生物循环发光技术超灵敏检测miRNA的方法。

本发明为实现上述目的，采用以下技术方案：

一种非诊断目的基于poly(A)加尾及生物循环发光技术超灵敏检测miRNA的方法，包括下述步骤：

1)高特异性的磁球探针的制备:将链霉亲和素化的磁球与生物素化的分子茎环探针进行孵育反应得到；

2)磁球探针结合分离目标miRNA:将步骤1）得到的磁球探针加入到待测样品中进行反应，磁分离纯化去除上清液，出去非目标RNA分子；

3）poly(A)加尾放大信号：poly(A)聚合酶协同poly(A)聚合酶缓冲溶液针在步骤2）得到结合有目标miRNA的磁球探针上进行聚合反应，在miRNA的3’羟基末端延伸出重复的腺嘌呤核糖核苷酸序列，实现信号放大；

4）生物循环发光信号放大：核酸外切酶T对磁球上结合的腺嘌呤核糖核苷酸序列进行切割反应，形成AMP；通过加入腺苷酸激酶、丙酮酸激酶、脱氧胞嘧啶三磷酸和磷烯醇丙酮酸，可以实现AMP-ADP-ATP的转换，结合荧光素酶检测体系后实现ATP的循环检测，通过收集生物发光信号强度的变化即可实现miRNA的超灵敏定量检测。

所述的生物素化的分子茎环探针的碱基序列号为5’-CAACATCAGTCTGATAAGCTAACTGATGTCCGG-bio-3’。