[发明专利]一种人二倍体细胞ZFB细胞及其构建方法、规模化培养方法

说明书

本发明公开一种人二倍体细胞ZFB细胞及其构建方法、规模化培养方法，细胞的分类命名为ZFB‑2，保藏编号为CGMCC No.17481；ZFB‑3，保藏编号为CGMCC No.17482；ZFB细胞株的构建方法，包括如下步骤：取胚胎组织块贴壁培养；细胞长成致密单层时，采用含10％胎牛血清的MEM培养液培养上述单层细胞并传代；弃去细胞培养上清液，消化，冻存；ZFB细胞的规模化培养方法，包括如下步骤：取工作细胞库的ZFB细胞株，接种于一级生物反应器中进行细胞的扩增；取一级生物反应器中覆盖满细胞的微载体，洗涤，再加入含有0.1％胶原蛋白酶的胰蛋白酶，消化；然后接种于二级生物反应器进行培养。本发明提出的ZFB‑2细胞、ZFB‑3细胞状态良好，生长快速、传代寿命长，对病毒的敏感性高，便于广泛使用。

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种人二倍体细胞ZFB细胞及其构建方法、规模化培养方法。

背景技术

人二倍体细胞是从人体正常组织(通常来源于胚胎)中分离的，并在体外培养传代建立的细胞株。人二倍体细胞(如WI-38、MRC-5、KMB-17、2BS等) 具有有限的生长代次，传代寿命一般在40-60代，超过一定的代次后细胞将停止增殖，并逐渐衰老、死亡。在其传代寿命内，人二倍体细胞具有广泛的病毒敏感性，良好的稳定性，无致瘤性。除终末代次的细胞会出现低概率的染色体条数和结构异常的外，其他代次的人二倍体细胞基本上能保持二倍体核型，与原代细胞相比，人二倍体细胞可以建立成熟的细胞库系统，并且能够达到充分鉴定和标准化的水平，从而有利于质量控制。与连续传代细胞相比，人二倍体细胞理论上没有致瘤性的危险。从上个世纪60年代，人二倍体细胞被国际接受用于生产疫苗以来，已经有数以十亿剂的人二倍体细胞生产的病毒疫苗服务于全球，并且人二倍体细胞生产的病毒疫苗被证实是安全有效的。人二倍体细胞已被世界卫生组织(World Health Organization，简称“WHO”)推荐为较为安全的病毒性疫苗生产用细胞基质。

人二倍体细胞株具有极为广泛的病毒易感性，为病毒研究和病毒诊断增添了新的手段(Fortunato,2014)。据不完全统计，二倍体细胞对大约200种病毒易感。在国外，用于病毒培养并建立细胞库的主要人二倍体细胞是WI-38和 MRC-5。但是考虑到WI-38细胞因为检测到曾被污染，现已不用于疫苗生产。 MRC-5细胞因为WHO授权的细胞数量稀少，加之二倍体细胞自身代次有限，目前生产用一般最高为35代，导致抗原产量严重受限，而且多种病毒在该种细胞上适应的病毒滴度有待提高，特别是乙脑病毒。因此，需要一种传代寿命长、病毒敏感性高的人二倍体细胞。

发明内容

针对上述问题，本发明公开了一种人二倍体细胞ZFB细胞，该细胞的分类命名为人胚肺纤维细胞ZFB-2，保藏编号为CGMCC No.17481。

一种人二倍体细胞ZFB细胞，该细胞的分类命名为人胚肺纤维细胞ZFB-3，保藏编号为CGMCC No.17482。

一种人二倍体细胞ZFB细胞株的构建方法，包括如下步骤：

步骤一、取胚胎组织块漂洗至组织块发白，将组织块转移至细胞培养瓶中加入MEM培养液贴壁培养；

步骤二、到达预设时间后换液，观察，直至细胞长成致密单层细胞；

步骤三、采用含10％胎牛血清的MEM培养液培养所述单层细胞并传代；

步骤四、细胞传代完成后，弃去细胞培养上清液，加入胰蛋白酶消化，消化后加入细胞冻存液、分装入细胞冻存管冻存。

进一步地，所述步骤三中细胞传代频率为2-3天传代一次，且每次传代按 1:2-1:4分种率接种。

进一步地，所述步骤三中传代第3-8代为原始细胞库，第15-16代为主细胞库，第20-21代为工作细胞库。

一种人二倍体细胞ZFB细胞的规模化培养方法，包括如下步骤：