[发明专利]一种人二倍体细胞ZFB细胞及其构建方法、规模化培养方法

权利要求书

1.一种人二倍体细胞ZFB细胞，其特征在于：该细胞的分类命名为人胚肺纤维细胞ZFB-2，保藏编号为CGMCC No.17481。

2.一种人二倍体细胞ZFB细胞，其特征在于：该细胞的分类命名为人胚肺纤维细胞ZFB-3，保藏编号为CGMCC No.17482。

3.一种人二倍体细胞ZFB细胞株的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：

步骤一、取胚胎组织块漂洗至组织块发白，将组织块转移至细胞培养瓶中加入MEM培养液贴壁培养；

步骤二、到达预设时间后换液，观察，直至细胞长成致密单层细胞；

步骤三、采用含10％胎牛血清的MEM培养液培养所述单层细胞并传代；

步骤四、细胞传代完成后，弃去细胞培养上清液，加入胰蛋白酶消化，消化后加入细胞冻存液、分装入细胞冻存管冻存。

4.根据权利要求3所述的一种人二倍体细胞ZFB细胞株的构建方法，其特征在于：所述步骤三中细胞传代频率为2-3天传代一次，且每次传代按1:2-1:4分种率接种。

5.根据权利要求3所述的一种人二倍体细胞ZFB细胞株的构建方法，其特征在于：所述步骤三中传代第3-8代为原始细胞库，第15-16代为主细胞库，第20-21代为工作细胞库。

6.一种如权利要求1或2所述人二倍体细胞ZFB细胞的规模化培养方法，其特征在于：包括如下步骤：

步骤一、取细胞库代次为20代或21代的ZFB细胞株，加入到细胞生长液中，利用胰蛋白酶消化细胞，传代扩增，制成细胞悬液并接种于一级生物反应器中进行细胞的扩增；

步骤二、取微载体经磷酸缓冲盐溶液水化后灭菌，加入无菌的一级生物反应器和二级生物反应器中，用细胞生长液孵育微载体；

步骤三、取所述一级生物反应器中覆盖满细胞的微载体，加入预热的磷酸缓冲盐溶液洗涤，再加入含有0.1％胶原蛋白酶的胰蛋白酶，消化细胞；

步骤四、将消化后的细胞和微载体悬液混匀，接种于二级生物反应器进行培养。

7.根据权利要求6所述的一种人二倍体细胞ZFB细胞的规模化培养方法，其特征在于：所述步骤一中消化后的细胞传代至若干个十层细胞工厂，且传代率为1:3。

8.根据权利要求6所述的一种人二倍体细胞ZFB细胞的规模化培养方法，其特征在于：所述步骤一中一级生物反应器扩增细胞的培养参数为：温度37℃，转速40～50rpm，溶氧30～50％，pH为7.2～7.3，碱自动控制。

9.根据权利要求6所述的一种人二倍体细胞ZFB细胞的规模化培养方法，其特征在于：所述步骤一中，待ZFB细胞汇合率达到90％以上时，加入胰蛋白酶消化细胞。

10.根据权利要求6所述的一种人二倍体细胞ZFB细胞的规模化培养方法，其特征在于：所述步骤二中所述一级生物反应器与所述二级生物反应器微载体使用总量为1:3～1:5。

11.根据权利要求6所述的一种人二倍体细胞ZFB细胞的规模化培养方法，其特征在于：所述步骤二中细胞生长液孵育微载体时设置参数为：温度36～38℃，转速40～50rpm，溶氧30～50％，pH为7.2～7.4。

12.根据权利要求6所述的一种人二倍体细胞ZFB细胞的规模化培养方法，其特征在于：所述步骤三中待90％细胞消化脱离微载体得到分散均匀的细胞悬液，所述一级生物反应器的转速设置为50rpm，添加细胞生长液，收集消化的细胞和微载体悬液。