[发明专利]通过过表达马铃薯StDWF1基因促进马铃薯块茎萌芽的方法

权利要求书

1.一种通过过表达马铃薯StDWF1基因促进马铃薯萌发和增加产量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)通过农杆菌介导制备过表达马铃薯StDWF1材料

①制备转化后的农杆菌菌液

采用限制性内切酶对含有StDWF1目的基因片段的表达载体和过表达载体进行双酶切，将酶切得到的载体和目的片段回收并连接，将连接产物转化至感受态细胞中，挑取单菌落扩繁、提取质粒，经PCR、酶切和测序鉴定后转化到根癌农杆菌的感受态细胞中，制得转化后的农杆菌菌液；

②马铃薯苗的诱导

以马铃薯苗的茎段作为外植体接入基本培养基中，置于温度为18±1℃、光照时间为8h/16h day/night、光照强度为35-45μmol m^-2s^-1的条件下培养15-20天；

③农杆菌的活化及重悬

④预培养及共培养

预培养：取培养了15-20天的马铃薯苗，在无菌条件下取中间生长健壮且无芽眼的茎段，置于预培养基上，于20-24℃暗培养2-3天；

预培养基的成分为：MS培养基+0.6wt％琼脂+3wt％蔗糖+2mg/L 6-BA+0.25mg/L TDZ+0.1mg/L GA₃+0.03mg/L 2,4-D，pH值为5.9-6.0；

共培养：将重悬的农杆菌浸染预培养后的茎段2-3min，然后用无菌水清洗2遍，去掉多余水分后，接入垫有一层滤纸的共培养基中，于24-26℃暗培养36h；

⑤芽诱导及根诱导

芽诱导：将共培养后的茎段放入含100mg/L Cef的无菌水中清洗3-4遍，去掉多余水分后转入芽筛选培养基中进行培养，培养温度为23±1℃，光照强度为35-45μmol m^-2s^-1，光照时间为16h/8h day/night，每隔10-14天更换一次培养基；

芽筛选培养基的成分为：MS培养基+0.6wt％琼脂+3wt％蔗糖+2mg/L 6-BA+0.25mg/LTDZ+0.1mg/L GA₃+0.03mg/L 2,4-D+50mg/L Kan+100mg/L Cef+250mg/L Car，pH值为5.9-6.0；

根诱导：将长至0.5-1cm的再生芽剪下接入生根筛选培养基中进行培养，培养温度为20±1℃，光照强度为55-65μmol m^-2s^-1，光照时间为16h/8h day/night；

生根筛选培养基的成分为：MS培养基+0.6wt％琼脂+3wt％蔗糖+50mg/L Kan，pH值为5.9-6.0；

(2)过表达马铃薯StDWF1材料的鉴定

筛选步骤(1)所得材料中能够正常长出根的株系，提取其基因组DNA，以基因组DNA为模板进行目的基因PCR扩增及测序，确定转基因株系；

(3)组织培养过表达马铃薯StDWF1材料

将步骤(2)确定的转基因株系在基本培养基上进行培养，将培养10-15天后的转基因植株幼苗的顶芽或带叶的茎段1.0-1.5幼嫩 部分接种到MS培养基中，进行培养；

(4)将步骤(3)所得材料培养15天后移栽到大棚培养，最后测定块茎的萌发时间。

2.根据权利要求1所述的通过过表达马铃薯StDWF1基因促进马铃薯萌发和增加产量的方法，其特征在于，基本培养基为MS培养基+0.6wt％琼脂+3wt％蔗糖，pH值为5.8-5.9。

3.根据权利要求1所述的通过过表达马铃薯StDWF1基因促进马铃薯萌发和增加产量的方法，其特征在于，步骤③中农杆菌的活化及重悬具体过程为：取转化后的农杆菌菌液在固体培养基中划线，然后置于28℃培养48h；挑取单菌落接种至含50mg/L Kan和50mg/L Rif的液体YEB中，在28℃，200rpm条件下培养过夜，最后对菌液进行稀释继续培养至OD₆₀₀＝0.4-0.6，离心，去上清，加入等体积的悬菌液重悬菌体。

4.根据权利要求3所述的通过过表达马铃薯StDWF1基因促进马铃薯萌发和增加产量的方法，其特征在于，步骤③中重悬液为MS培养基+3wt％蔗糖，pH值为5.9-6.0。

5.根据权利要求1所述的通过过表达马铃薯StDWF1基因促进马铃薯萌发和增加产量的方法，其特征在于，步骤④中共培养基的成分为：MS培养基+0.6wt％琼脂+3wt％蔗糖+2mg/L6-BA+0.25mg/L TDZ+0.1mg/L GA₃+0.03mg/L 2,4-D，pH值为5.9-6.0。