[发明专利]高通量自动化的微生物宏基因组16s rRNA基因文库构建的方法

说明书

本发明公开了高通量自动化的微生物宏基因组16s rRNA基因文库构建的方法，具体涉及分子生物学领域，具体步骤如下：S1、配制反应液；S2、设置仪器参数；S3、芯片制备；S4、PCR扩增；S5、离心回收；S6、琼脂糖凝胶电泳回收；S7、文库质控。本发明通过一种利用MSND自动化平台构建文库的方法，可以同时进行384个样本的建库，大大提升了芯片制备的通量和效率，实现了仪器自动化，节省了人力，提高了建库的通量、减少了实验成本、降低了样本的起始量，本方法仅需要切胶回收后的样本进行一次qPCR定量即可直接上机测序，更为高效，节约了试剂使用量并省去了繁琐的质控、pooling等步骤，仍能获得和常规建库方法一致的测序结果。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，更具体地说，本发明涉及高通量自动化的微生物宏基因组16s rRNA基因文库构建的方法。

背景技术

随着二代测序技术的快速发展，16S rRNA基因测序成为了细菌群落物种组成及群落多样性研究的常规方法，包括经典的16s rRNA基因高变区区域测序(基于illuminaMiseq平台)和全长测序(基于Sequel和MinION平台)。目前应用比较广泛的测序区域是16srRNA基因的V3-V4区域，通过和其它研究手段相结合，在微生物组学的研究中发挥了重要作用。

常规的16s rRNA基因的文库构建，是通过带有接头序列和index序列的PCR引物扩增其V3-V4区域，然后通过illumina平台进行测序。这种方法对于少量样本而言，操作简便，测序结果较好，价格偏低。随着微生物研究的逐渐深入以及测序价格的降低，目前出现了很多基于大量样本的群体进行分析的微生物群落研究。常规的16s rRNA基因的文库构建方法对于需要大量同时处理的样本而言，建库过程繁琐，周期长，成本相对较高。

因此，需要一种高通量、低成本、速度快、质量好的建库方案来解决以上问题。

发明内容

为了克服现有技术的缺陷，本发明的实施例提供高通量自动化的微生物宏基因组16s rRNA基因文库构建的方法，通过MSND平台以一张含有5184个反应孔的芯片作为载体，一次可以同时处理384个样本(每个样本12个技术重复)，另外每个反应孔的反应体系为100纳升，大大节约了试剂和样本使用量；通过使用带有接头序列的内引物选择性扩增特定区域DNA片段，再由带有barcode序列及适用于illumina平台测序的接头序列的外引物进行扩增，扩增结束后使用收集装置获得可直接用于测序的文库。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：高通量自动化的微生物宏基因组16srRNA基因文库构建的方法，具体步骤如下：

S1、配制反应液：取一个干净的384孔PCR板，在孔内配制芯片制备的反应液：

配制完反应液后，用移液器吹打混匀，然后离心备用；

S2、设置仪器参数：将MSND仪器的模式调为384×12模式，其中384代表384个样本，12代表12次重复实验；

S3、芯片制备：将配置好的384孔板放入MSND仪器内，同时将SmartChip芯片也放入到仪器中对应的位置，点击开始自动化点样仪MSND将自动把384孔板中的文库构建所需的PCR反应体系喷液到5184孔SmartChip芯片上；待仪器运行完成，将SmartChip芯片取下，盖上封口膜放到冰盒上备用；

S4、PCR扩增；

S4.1、设置PCR仪的扩增程序；

S4.2、然后将PCR程序设置为“盖子加热到105℃”；

S4.3、PCR仪设置完成之后，将SmartChip芯片放到PCR仪上，盖上盖子进行PCR扩增；

S5、离心回收；