[发明专利]高通量自动化的微生物宏基因组16s rRNA基因文库构建的方法

权利要求书

1.高通量自动化的微生物宏基因组16s rRNA基因文库构建的方法，其特征在于，具体步骤如下：

S1、配制反应液：取一个干净的384孔PCR板，在孔内配制芯片制备的反应液：

配制完反应液后，用移液器吹打混匀，然后离心备用；

S2、设置仪器参数：将MSND仪器的模式调为384×12模式，其中384代表384个样本，12代表12次重复实验；

S3、芯片制备：将配置好的384孔板放入MSND仪器内，同时将SmartChip芯片也放入到仪器中对应的位置，点击开始自动化点样仪MSND将自动把384孔板中的文库构建所需的PCR反应体系喷液到5184孔SmartChip芯片上；待仪器运行完成，将SmartChip芯片取下，盖上封口膜放到冰盒上备用；

S4、PCR扩增；

S4.1、设置PCR仪的扩增程序；

S4.2、然后将PCR程序设置为“盖子加热到105℃”；

S4.3、PCR仪设置完成之后，将SmartChip芯片放到PCR仪上，盖上盖子进行PCR扩增；

S5、离心回收；

S5.1、PCR结束之后，将芯片取出，离心后小心撕掉封口膜，避免膜的胶残留在Chip上；

S5.2、装好芯片配备的收集槽，将收集槽放置到附带的离心架上；

S5.3、将芯片倒扣在收集槽上，贴上封槽膜；

S5.4、离心结束后，将离心管取下，离心管中为完成文库构建的384个文库的混合样本，做好标记，存放到-20℃冰箱；

S6、琼脂糖凝胶电泳回收；

S6.1、配制2％的琼脂糖凝胶；

S6.2、将PCR产物进行电泳；

S6.3、电泳结束后，在紫外灯的照射下，将PCR产物的500-750bp的条带用刀片切下，放入干净的离心管中；

S6.4、使用QIAquick胶回收试剂盒对切下的条带进行回收；

S6.5、回收结束后，做好标记，存放到-20℃冰箱；

S7、对切胶回收的文库进行质控：利用qPCR检测浓度，利用Agilent2100检测片段大小。

2.根据权利要求1所述的高通量自动化的微生物宏基因组16s rRNA基因文库构建的方法，其特征在于：所述步骤S1中，上游引物、下游引物和dNTP浓度均为10mM，DNA聚合酶和10×buffer(with Mg2+)浓度均为5U/μL，DNA浓度为5ng/μL。

3.根据权利要求1所述的高通量自动化的微生物宏基因组16s rRNA基因文库构建的方法，其特征在于：所述步骤S4.1中，设置PCR仪的扩增程序包括预变性、变性、退火、延伸、再延伸、保存共6个程序。

4.根据权利要求3所述的高通量自动化的微生物宏基因组16s rRNA基因文库构建的方法，其特征在于：所述步骤S4.1中，预变性、变性、退火、延伸、再延伸、保存共6个程序分别对应的温度为95℃、95℃、60℃、72℃、72℃、4℃。

5.根据权利要求3所述的高通量自动化的微生物宏基因组16s rRNA基因文库构建的方法，其特征在于：所述步骤S4.1中，6个程序分别对应的时间为3分钟、30秒、30秒、1分钟、5分钟、∞。

6.根据权利要求3所述的高通量自动化的微生物宏基因组16s rRNA基因文库构建的方法，其特征在于：所述步骤S4.1中，6个程序分别对应的循环数为1cycle、35cycles、35cycles、35cycles、1cycle、1cycle。

7.根据权利要求3所述的高通量自动化的微生物宏基因组16s rRNA基因文库构建的方法，其特征在于：所述步骤S3中，SmartChip芯片含有5184个反应孔，每个反应孔的反应体系为100纳升。

8.根据权利要求1所述的高通量自动化的微生物宏基因组16s rRNA基因文库构建的方法，其特征在于：所述步骤S5.3中，贴上封槽膜后的芯片放到离心机中离心，离心速度为4000rpm，离心时间为5min。

9.根据权利要求1所述的高通量自动化的微生物宏基因组16s rRNA基因文库构建的方法，其特征在于：所述步骤S6.2中，PCR产物电泳时的电压为100V，电泳时间为2小时。