[发明专利]一种荧光探针及其在pH值和氧化还原状态检测中的应用

说明书

本申请属于生物荧光探针技术领域，具体涉及一种荧光探针及其在pH值和氧化还原状态检测中的应用专利申请事宜。该探针利用绿色荧光蛋白iLOV和具有long‑stokes位移的红色荧光蛋白mBeRFP荧光蛋白制备而成，用于细胞内pH值和氧化还原状态的双重监测；应用时，利用iLOV蛋白荧光变化检测氧化还原状态，利用mBeRFP蛋白荧光变化检测pH值。相关检测结果准确可靠，且灵敏度较高，并且证明了iLOV的发射光光谱是随着氧化状态变化而发生梯度改变的，而mBeRFP荧光蛋白的荧光强度则随着pH梯度发生改变。基于这些结果，可为新型探针设计、细胞信号转导研究、细胞状态研究等奠定一定技术基础。

技术领域

本申请属于生物荧光探针技术领域，具体涉及一种荧光探针及其在pH值和氧化还原状态检测中的应用专利申请事宜。

背景技术

生物细胞学研究中，活性氧（ROS）是一个重要的研究对象，最初活性氧被认为是具有细胞毒性的代谢副产物，但现有研究认为，细胞中所产生的活性氧（ROS）如羟自由基几乎可以和所有的生物分子发生反应，如色素、蛋白、脂类和DNA并开启细胞的程序性死亡，因此越来越多的证据证明活性氧是动植物细胞中调节从细胞防御到细胞生长过程中的重要因子。

活性氧（ROS）研究中，常用研究方法之一利用探针进行检测。而现有检测ROS用探针多是基于GFP（绿色荧光蛋白）改造的，这类ROS探针在一定程度上受pH影响较大，这是由于GFP本身的属性所决定的。例如越来越多的研究发现在使用Hyper监测H₂O₂的过程中，pH的影响很难被排除，此外Hyper的荧光可能受H₂O₂之外的ROS因子影响（Weller et al., 2014，Response properties of the genetically encoded optical H2O2 sensor HyPer，FreeRadic Biol Med）。因此设计一种不受pH影响的监测ROS用探针是十分必要的。

现有研究表明，细胞胞质和不同细胞器环境中的pH值是有明显区别的，例如：质外体的pH范围在5~6，胞质6.4~7.7，液泡 5.2~6.5，核 7.2~7.3。而这种pH的差异使得细胞内部不同条件的酶促反应可以正常进行，进而维持着细胞的生长、极化、囊泡运输和细胞骨架形成。这些反应过程中，H⁺作为信号转导的介质参与并影响着动植物的生长发育已经被广泛认可。而针对H⁺检测用的pH荧光探针为研究不同pH条件下各种信号转导途径提供了有效手段。但另一方面，由于细胞内的氧化还原状态和pH变化之间存在千丝万缕的联系，因此，如何实现氧化还原状态和pH的双重监测仍然是需要克服的技术难题之一。

发明内容

本申请目的在于提供一种可以同时检测pH值和氧化还原状态的双重荧光探针，从而为相关细胞状态的判定奠定一定技术基础。

本申请所采取的技术方案详述如下。

一种荧光探针，该探针利用绿色荧光蛋白iLOV和具有long-stokes位移的红色荧光蛋白mBeRFP荧光蛋白制备而成，主要用于细胞内pH值和氧化还原状态的双重监测；应用时，利用iLOV蛋白荧光变化检测氧化还原状态，利用mBeRFP蛋白荧光变化检测pH值；

具体通过如下步骤制备而成：

（1）构建含有iLOV基因序列的重组质粒pYES2-iLOV

以pGEX-iLOV为模板，PCR获得iLOV序列；PCR扩增时，引物序列设计如下：

正向引物iLOV-F：5' –CGAAGCTTCCAATGTCTATAGAGAAGAATTTCGTC-3'，

反向引物iLOV-R：5' –GCTGGATCCGCTATACATGATCACTTCCATC-3'；