[发明专利]一种制备人定型内胚层细胞的方法

说明书

本发明提供了一种制备人定型内胚层细胞的方法，属于干细胞诱导与再生医疗技术领域。本发明的方法是将GDF3基因克隆到慢病毒载体，包装慢病毒；将包装后的慢病毒感染人体多潜能干细胞，抗性筛选获得稳定表达细胞系；使用小分子，诱导这种细胞系分化为内胚层细胞。本发明制备的内胚层细胞是通过GDF3诱导产生，且成本低廉，易于操作，可用于制备内胚层衍生细胞，并应用于组织工程，应用前景广阔。

技术领域

本发明属于干细胞诱导与再生医疗技术领域，具体地说，涉及一种制备人定型内胚层细胞的方法。

背景技术

干细胞由于具有强大的增殖能力和分化为各种体细胞的潜能，因此是一种新的细胞来源，可以应用于再生医疗和组织工程。多潜能干细胞由于具有分化的全能性，其无限的增殖能力和发育为所有体细胞的能力也都得到充分证明，因此是一种非常有前景的细胞来源。人多潜能干细胞包括人胚胎(ES)干细胞和诱导多潜能(iPS)干细胞，其分化产生的内胚层细胞可以进一步发育为肝脏、肺、胰腺、肠和胃，因此在治疗脏器疾病或者开发相关的药物上有着广泛的用途。

内胚层细胞包括定型内胚层和胚外内胚层，能够定型发育为肝脏、肺、胰腺、肠和胃等组织的干细胞内胚层，称为定型内胚层细胞。

转化生长因子beta(Transforming Growth Factor beta，TGFb)超家族成员包括TGF-beta蛋白,骨形成蛋白(Bone Morphogenetic Proteins，BMPs),生长分化因子蛋白(Growth Differentiation Factors，GDFs),胶质衍生的神经生长因子(Glial-derivedNeurotrophic Factors，GDNFs)等。在小鼠胚胎发育中，TGFb家族蛋白Activin A，Nodal和TGFb1以及GDF家族的GDF3，GDF8对于内胚层的形成有重要作用。应用人多潜能干细胞的分化上，Activin A、Nodal、TGFb1和GDF8均能诱导人多潜能干细胞分化为内胚层细胞。但是不同的蛋白诱导产生的内胚层细胞存在一定差异，表现在脂肪代谢和糖代谢差异。在目前诱导人多潜能干细胞向内胚层细胞分化的过程中，使用高浓度的重组Activin A蛋白是比较常见的一种方法。但是对于GDF3诱导人多潜能干细胞分化为内胚层细胞则没有报道。因此对于GDF3诱导分化产生的内胚层细胞的性质和分化特征并没有进行研究。

Tet-On诱导表达的系统是一种可调控的基因表达体系。在没有四环素类物质存在时，外源基因不会开启表达。当加入四环素类似物比如强力霉素(Doxcylin,Dox)时，rtTA可以结合到启动子上从而开启外源基因的表达，因此是一种很方便的调控表达体系。通常Tet-On表达系统由两个质粒组成，其中一个提供调控蛋白rtTA，另一个提供弱启动子驱动的外源基因。可以将两个质粒合并到一个质粒上，即成为Tet-One载体，方便转基因的表达。

慢病毒载体是经过改造后的假病毒，其本身不能复制，需要在包装细胞系比如293T细胞里组装出来。其宿主广泛，可以高效的感染人多潜能干细胞，并能逃避甲基化抑制，从而稳定的表达外源基因。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种制备人定型内胚层细胞的方法。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：构建TetOne-Modified-GDF3的单一慢病毒载体；包装TetOne-Modified-GDF3的慢病毒；感染人多潜能干细胞系，并加入嘌呤霉素杀死未转入基因的细胞；扩增多潜能干细胞，然后传代扩增，扩增后的细胞在Dox作用下，诱导分化为内胚层细胞。

具体地，本发明提供了一种制备人定型内胚层细胞的方法，是在人诱导多潜能干细胞或者分化早期的多潜能干细胞中表达或过表达GDF3基因。