[发明专利]一种制备人定型内胚层细胞的方法有效

专利信息
申请号: 201910804587.4 申请日: 2019-08-28
公开(公告)号: CN110540962B 公开(公告)日: 2022-02-25
发明(设计)人: 周云卿;陈昱安;刘凤林;孙浩;蔡军 申请(专利权)人: 北京协同创新研究院
主分类号: C12N5/10 分类号: C12N5/10;C12N15/867;C12N15/12
代理公司: 北京路浩知识产权代理有限公司 11002 代理人: 陈征
地址: 100094 北京市海*** 国省代码: 北京;11
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摘要:
搜索关键词: 一种 制备 人定 胚层 细胞 方法
【权利要求书】:

1.一种制备人定型内胚层细胞的方法,其特征在于,通过构建TetOne-Modified-GDF3的单一慢病毒载体;包装TetOne-Modified-GDF3的慢病毒;感染人多潜能干细胞系,并加入嘌呤霉素杀死未转入基因的细胞;扩增多潜能干细胞,然后传代扩增,扩增后的细胞在Dox作用下,诱导分化为内胚层细胞;从而在人诱导多潜能干细胞或者分化早期的多潜能干细胞中表达或过表达GDF3基因,其中,所述的人诱导多潜能干细胞或者分化早期的多潜能干细胞均为商用干细胞;

所述GDF3基因的cDNA序列为SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列;

所述方法包括以下步骤:

(1)将GDF3基因插入慢病毒载体中,并对慢病毒载体进行包装;所述的慢病毒载体为Tetone-Modifed,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;所述慢病毒载体Tetone-Modifed通过以下方法制备得到,以pLVX-TetOne-Puro质粒为骨架载体,去除了pLVX-TetOne-Puro质粒上一段SV40 polyA signal序列,并且将启动嘌呤霉素表达的SV40启动子更换为了T2A序列,改造后的质粒命名为TetOne-Modified;

(2)将步骤(1)的载体转入人诱导多潜能干细胞或者分化早期的多潜能干细胞,并加嘌呤霉素筛选,获得稳定整合的干细胞;所述嘌呤霉素在PGM1培养基中的浓度为0.5-2μg/ml;

(3)将步骤(2)的细胞加入强力霉素,诱导分化为人定型内胚层细胞,所述强力霉素的使用浓度为100ng/ml;

其中,步骤(1)中,将GDF3基因插入慢病毒载体的步骤包括:

1)Tetone-Modifed质粒用R3136S,New England Biolabs和 R3101S,New EnglandBiolabs双酶切线性化,之后通过琼脂糖凝胶电泳分离回收线性化的质粒;

2)从肝细胞cDNA文库中扩增GDF3 cDNA序列,引物序列为:

F:TCCTACCCTCGTAAAGATGCTTCGTTTCTTGCCAGATTTGGC

R:CCAGTTTATCGACTTGCTACCCACACCCACATTCATCGACTA;

3)将扩增的GDF3 cDNA序列连入线性化的 Tetone-Modifed质粒,所述cDNA序列为SEQID NO.2;

4)筛选阳性克隆并测序验证,测序正确的慢病毒命名为 Tetone-Modifed-GDF3;

5)对慢病毒Tetone-Modifed-GDF3进行包装。

2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述人诱导多潜能干细胞为iPS细胞;或任一种NIH编号的人胚胎干细胞系,所述人胚胎干细胞系为商用。

3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述嘌呤霉素在PGM1培养基中的浓度为 1μg/ml。

4.一种人定型内胚层细胞或其衍生细胞,其特征在于,所述人定型内胚层细胞或其衍生细胞是通过构建TetOne-Modified-GDF3的单一慢病毒载体;包装TetOne-Modified-GDF3的慢病毒;感染人多潜能干细胞系,并加入嘌呤霉素杀死未转入基因的细胞;扩增多潜能干细胞,然后传代扩增,扩增后的细胞在Dox作用下,诱导分化为内胚层细胞;从而在人诱导多潜能干细胞或者分化早期的多潜能干细胞中过表达GDF3基因;使得所述人定型内胚层细胞或其衍生细胞含有高拷贝数的GDF3基因或含有能够表达GDF3基因的表达载体,所述GDF3基因的cDNA序列为SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列;

所述人定型内胚层细胞或其衍生细胞通过以下步骤制备:

(1)将GDF3基因插入慢病毒载体中,并对慢病毒载体进行包装;所述的慢病毒载体为Tetone-Modifed,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;所述慢病毒载体Tetone-Modifed通过以下方法制备得到,以pLVX-TetOne-Puro质粒为骨架载体,去除了pLVX-TetOne-Puro质粒上一段SV40 polyA signal序列,并且将启动嘌呤霉素表达的SV40启动子更换为了T2A序列,改造后的质粒命名为TetOne-Modified;

(2)将步骤(1)的载体转入人诱导多潜能干细胞或者分化早期的多潜能干细胞,并加嘌呤霉素筛选,获得稳定整合的干细胞;所述嘌呤霉素在PGM1培养基中的浓度为0.5-2μg/ml;

(3)将步骤(2)的细胞加入强力霉素,诱导分化为人定型内胚层细胞,所述强力霉素的使用浓度为100ng/ml;

其中,步骤(1)中,将GDF3基因插入慢病毒载体的步骤包括:

1)Tetone-Modifed质粒用R3136S,New England Biolabs和 R3101S,New EnglandBiolabs双酶切线性化,之后通过琼脂糖凝胶电泳分离回收线性化的质粒;

2)从肝细胞cDNA文库中扩增GDF3 cDNA序列,引物序列为:

F:TCCTACCCTCGTAAAGATGCTTCGTTTCTTGCCAGATTTGGC

R:CCAGTTTATCGACTTGCTACCCACACCCACATTCATCGACTA;

3)将扩增的GDF3 cDNA序列连入线性化的 Tetone-Modifed质粒,所述cDNA序列为SEQID NO.2;

4)筛选阳性克隆并测序验证,测序正确的慢病毒命名为 Tetone-Modifed-GDF3;

5)对慢病毒Tetone-Modifed-GDF3进行包装。

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