[发明专利]一种类胡萝卜素代谢基因功能鉴定方法

说明书

本发明公开了一种类胡萝卜素代谢基因功能鉴定方法，包括以下步骤：S1：克隆筛选标记元件：从pGBK‑T7载体中克隆了由Amp^r启动子驱动的卡那霉素抗性基因Kan^r，以此元件(pAmp^r::Kan^r)作为后续的筛选标记；S2：克隆启动子：克隆了蓝细菌集胞藻Synechocystis sp.PCC6803中的RuBisCO大亚基基因(rbcL)的启动子序列，该启动子用于驱动待检测的酶基因；S3：酶基因的克隆：来自不同生物的待鉴定类胡萝卜素代谢相关酶基因X克隆于rbcL启动子的下游(rbcL::X)，由该启动子驱动；S4:表达盒的构建：一个完整的基因表达盒包括依次排列的一个pAmp^r::Kan^r筛选标记元件以及一个用于表达酶蛋白的rbcL::X元件。与传统鉴定方法相比，本方法具有更加简便、直接的优势，可以明确而有针对性地对基因功能进行鉴定。

技术领域

本发明涉及基因功能鉴定技术领域，尤其涉及一种类胡萝卜素代谢基因功能鉴定方法。

背景技术

类胡萝卜素在自然界中广泛分布。它们通常起到光捕获以及作为光保护色素的作用，此外还为植物的花粉提供了鲜明的颜色帮助种子传播。对于人类来说，这类化合物有益于人体健康，是日常饮食中必需的植物营养素。几乎所有的光合生物都能够合成常见的类胡萝卜素(番茄红素和β-胡萝卜素)，而在高等植物中则出现了更多类型的类胡萝卜素，包括叶黄素及其氧化衍生物等。但是一些特殊的类胡萝卜素仅存在于特定的物种中，例如雨生红球藻中的虾青素以及莴苣中的莴苣黄素。如果能够鉴定催化这些独特类胡萝卜素合成的酶，将有助于通过基因工程和合成生物学的策略来对其进行大量合成。常规生物化学研究中酶活鉴定工作通常使用水溶液体系，利用重组酶蛋白来进行体外酶活反应来测定其产物。但是同样的策略在对类胡萝卜素合成途径的研究中却很难实现，因为参与其中的大多数酶利用的类胡萝卜素底物以及对应产物都是脂溶性的，在水溶液体系中不便对类胡萝卜素代谢酶功能进行鉴定。因此我们提出了一种利用能够合成简单类胡萝卜素成分的蓝细菌来对类胡萝卜素代谢基因功能进行活体鉴定的方法，用来解决上述问题。

发明内容

基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种类胡萝卜素代谢基因功能鉴定方法。

本发明提出的一种类胡萝卜素代谢基因功能鉴定方法，包括以下步骤：

S1：克隆筛选标记元件：从pGBK-T7载体中克隆了由Amp^r启动子驱动的卡那霉素抗性基因Kan^r，以此元件(pAmp^r::Kan^r)作为后续的筛选标记；

S2：克隆启动子：克隆了蓝细菌集胞藻Synechocystis sp.PCC6803中的RuBisCO大亚基基因(rbcL)的启动子序列，该启动子用于驱动待检测的酶基因；

S3：酶基因的克隆：来自不同生物的待鉴定类胡萝卜素代谢相关酶基因X克隆于rbcL启动子的下游(rbcL::X)，由该启动子驱动；

S4:表达盒的构建：一个完整的基因表达盒包括依次排列的一个pAmp^r::Kan^r筛选标记元件以及一个用于表达酶蛋白的rbcL::X元件；

S5：质粒构建：在构建好的表达盒的两端，通过PCR技术扩增引入集胞藻基因组插入位点两侧的同源臂序列，并将扩增片段克隆到载体中；

S6：蓝细菌菌株培养：选取合适的蓝细菌菌株，并对蓝细菌菌株进行培养；

S7:蓝细菌的转化：S5克隆的质粒通过自然转化的方法转化蓝细菌；经转化的蓝细菌在含有50μg·ml^-1卡那霉素的BG-11培养基平板上筛选，其他培养筛选条件同S6；