[发明专利]一种类胡萝卜素代谢基因功能鉴定方法

权利要求书

1.一种类胡萝卜素代谢基因功能鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：克隆筛选标记元件：从pGBK-T7载体中克隆了由Amp^r启动子驱动的卡那霉素抗性基因Kan^r，以此元件(pAmp^r::Kan^r)作为后续的筛选标记；

S2：克隆启动子：克隆了蓝细菌集胞藻Synechocystis sp.PCC6803中的RuBisCO大亚基基因(rbcL)的启动子序列，该启动子用于驱动待检测的酶基因；

S3：酶基因的克隆：来自不同生物的待鉴定类胡萝卜素代谢相关酶基因X克隆于rbcL启动子的下游(rbcL::X)，由该启动子驱动；

S4:表达盒的构建：一个完整的基因表达盒包括依次排列的一个pAmp^r::Kan^r筛选标记元件以及一个用于表达酶蛋白的rbcL::X元件；

S5：质粒构建：在构建好的表达盒的两端，通过PCR技术扩增引入集胞藻基因组插入位点两侧的同源臂序列，并将扩增片段克隆到载体中；

S6：蓝细菌菌株培养：选取合适的蓝细菌菌株，并对蓝细菌菌株进行培养；

S7:蓝细菌的转化：S5克隆的质粒通过自然转化的方法转化蓝细菌；经转化的蓝细菌在含有50μg·ml^-1卡那霉素的BG-11培养基平板上筛选，其他培养筛选条件同S6；

S8：色素鉴定：当S7液体培养基中蓝细菌生长至OD₇₀₀＝2.0时，取5ml菌液离心收集细胞，以甲醇抽提积累的类胡萝卜素，利用高效液相色谱法对色素进行分离鉴定；

所述S4中，当有两个酶基因需要同时表达时，在两个基因的开放阅读框之间插入一段原核生物多顺反子中的核糖体结合序列(ribosome binding site,rbs)，这样rbcL启动子可以同时驱动其下游两个酶基因的表达；

所述S5中，选择的集胞藻基因组插入位点为编码胡萝卜素酮解酶CrtO基因的中端，破坏该基因的正常表达有助于进一步简化集胞藻中的胡萝卜素代谢以及促进β-胡萝卜素的积累；

所述S6中，培养条件为BG-11培养基，28-30℃，30-35μmol·photon·m^-2·s^-1；

所述S7中，经转化的蓝细菌在含有50μg·ml^-1卡那霉素的BG-11培养基平板上筛选，挑选筛选得到的转基因菌株，在含有50μg·ml^-1卡那霉素的BG-11液体培养基中培养生长；生长条件为BG-11培养基，28-30℃，30-35μmol·photon·m^-2·s^-1。