[发明专利]哈维氏弧菌高效裂解性噬菌体vB-VhaS-yong1及其应用在审
| 申请号： | 201910789221.4 | 申请日： | 2019-08-14 |
| 公开（公告）号： | CN112442487A | 公开（公告）日： | 2021-03-05 |
| 发明（设计）人： | 许丽华;李登峰;秦伟南;童贻刚;林威;孙智同;王春琳;母昌考;韩胜明 | 申请（专利权）人： | 宁波大学 |
| 主分类号： | C12N7/00 | 分类号： | C12N7/00;C12N7/02;A61K35/76;A61P31/04;A01P1/00;C12R1/92 |
| 代理公司： | 暂无信息 | 代理人： | 暂无信息 |
| 地址： | 315211 浙*** | 国省代码： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 哈维 弧菌 高效 裂解 噬菌体 vb vhas yong1 及其 应用 | ||
【权利要求书】：
1.哈维氏弧菌的一种烈性噬菌体vB_VhaS-Yong 1，该噬菌体于2019年7月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18193。
2.根据权利要求1所述的哈维氏弧菌的一种烈性噬菌体vB_VhaS-Yong 1，该噬菌体具有如下生物学特征：是首株以高致病性哈维氏弧菌LDF为靶标分离获得的噬菌体，命名为vB_VhaS-Yong 1；vB_VhaS-Yong 1可感染并裂解高致病性哈维氏弧菌LDF，使菌液澄清化，在哈维氏弧菌LDF的菌平板上可以形成透明的噬菌斑。
3.根据权利要求1所述的哈维氏弧菌的一种烈性噬菌体vB_VhaS-Yong 1，该噬菌体具有如下生物学特征：呈现二十面体近似球形的头部，直径约为58nm，尾部长度约为212nm；vB_VhaS-Yong 1基因组为双链DNA(dsDNA)，其序列不存在于已有数据库中，是一株未被报导的新的噬菌体。
4.根据权利要求1所述的哈维氏弧菌的一种烈性噬菌体vB_VhaS-Yong 1，该噬菌体具有如下生物学特征：分离自浙江省宁波市北仑区梅山岛海水，水样采集位置为Northlatitude：29.7831421，East longitude：121.9586032；具体制备方法如下：
(1)哈维氏弧菌LDF的活化、培养
取哈维氏弧菌LDF菌种划线接种于含2％琼脂的LB海水固体培养基平板上，29℃倒置培养过夜；从平板上挑取单菌落，接种到装有5mL LB海水液体培养基的试管内，摇床上29℃、180rpm培养12小时后，从试管中取1mL培养液至装有100mL LB海水液体培养基的锥形瓶中，放置于摇床上29℃、180rpm培养约3小时至菌液OD600≈0.6，即得到对数期菌液；
其中LB海水培养基的配方如下：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，用经棉花过滤的海水定容至1L，调pH至7.2，121℃高压灭菌20min；
(2)噬菌体的富集
取浙江省宁波市北仑区梅山岛海边表层海水(North latitude：29.7831421；Eastlongitude：121.9586032)，置冰盒内，并立即带回实验室，离心4℃ 10000g 10min，取40mL上清液于锥形瓶中，往瓶中加入20mL 3×LB海水液体培养基与1mL对数期哈维氏弧菌LDF菌液，混匀后放置于摇床上29℃、220rpm培养3小时进行噬菌体初步富集；将培养液离心4℃10000g 10min，取上清液依次经过0.45μm、0.22μm孔径针头过滤器过滤；取一支试管，加入4mL上述过滤液、2mL 3×LB海水液体培养基、100μL对数期哈维氏弧菌LDF菌液，混匀，作为实验组；另取一支试管加入6mL LB海水液体培养基、100μL对数期哈维氏弧菌LDF菌液混匀，作为对照组；将实验组、对照组试管放置于摇床上29℃、220rpm培养至实验组与对照组液体有肉眼可见差异，即实验组培养液变澄清、出现细菌碎片后，将实验组培养液即噬菌体富集液继续下一步实验或者4℃避光保存；
其中，3×LB海水液体培养基的配方如下：胰蛋白胨30g，酵母提取物15g，用经棉花过滤的海水定容至1L，调pH至7.2，121℃高压灭菌20min；
(3)噬菌体的分离、纯化
将步骤(2)获得的噬菌体培养富集液离心4℃，10000g，10min，取上清液，依次经过0.45μm、0.22μm孔径针头过滤器过滤后，用LB海水液体培养基做10倍梯度稀释，取各稀释度的稀释液100μL分别与200μL对数期LDF菌液混合，放置于29℃恒温培养箱中孵育10min使噬菌体吸附；从45℃水浴中取出一份4mL/管分装的含0.7％琼脂的LB海水培养基，立刻与孵育后的噬菌体-菌混合液混合，漩涡震荡3秒混匀后，倒于已于37℃预热30min以上的LB海水固体培养基平板上，均匀铺平；待凝固后将双层平板置于29℃培养箱中过夜培养，至平板上有噬菌斑形成；选取噬菌斑密度合适的平板，挑取单个噬菌斑中心位置琼脂，置于5mL对数期哈维氏弧菌LDF菌液中，摇床上29℃、220rpm培养至宿主菌裂解澄清；将培养液离心4℃ 10000g10min后，取上清液，依次经过0.45μm、0.22μm孔径针头过滤器过滤，过滤液即为新一代噬菌体原液；取新噬菌体原液继续使用上述双层平板法重复进行三代噬菌体分离、纯化实验，即得到纯化培养的噬菌体vB_VhaS-Yong 1原液；
(4)噬菌体的扩大培养
将步骤(3)纯化得到的第三代噬菌体-菌培养裂解液离心4℃ 10000g 10min，取上清液依次经过0.45μm、0.22μm孔径针头过滤器过滤，将过滤液与对数期哈维氏弧菌LDF菌液按体积200μL∶20mL的比例混合，作为实验组；设置20mL对数期LDF菌液作为对照组；将实验组和对照组一起放置于摇床上29℃，220rpm培养，至实验组与对照组液体出现肉眼可见差异时停止培养；将噬菌体-菌培养裂解液置于4℃保存；
(5)噬菌体悬液制备
取步骤(4)制备的噬菌体-菌培养裂解液离心4℃ 10000g 10min，取上清液，依次经过0.45μm、0.22μm孔径针头过滤器过滤，即为噬菌体vB_VhaS-Yong 1悬液。
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- 本发明公开了一种噬菌体及其制剂和应用。具体公开了克雷伯菌噬菌体Klebsiella phage，其噬菌体编号为YJ‑pK4‑26，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.25270，及上述噬菌体的相关应用，本发明的噬菌体可高效裂解产气克雷伯氏菌，尤其是PSgc4型产气克雷伯氏菌，在短时间内大量增殖，并对温度和酸碱度具有良好的耐受性，具有制备治疗由PSgc4型引起病症的药物的潜力。
- 一种猫杯状病毒毒株及其应用-202310716984.2
- 唐青海;喻正军;刘婷;石建;刘会敬;蔡行;胡意;曾沛暄;崔雅湘;杨灿;唐斯萍;杨海;王芳宇 - 衡阳师范学院;湖南中净生物科技有限公司
- 2023-06-16 - 2023-10-13 - C12N7/00
- 本发明首次从衡阳地区分离得到一株猫杯状病毒FCV‑HY220313毒株，经动物回归试验表明，FCV‑HY220313株具有较强的致病性，甚至致死性，该毒株具有较好的免疫原性，可以用于制备检测猫杯状病毒感染的试剂盒或者用于制备猫杯状病毒感染导致相关疾病的预防或治疗的药物，将其灭活后，具有良好的免疫原性，对于猫杯状病毒感染具有良好的预防作用。
- 一株禽腺病毒、菌株、Fiber-2蛋白、疫苗、亚单位疫苗、用途-202311137654.4
- 李永红;韩翡;郑铁锁;李静;陈坚;涂玉蓉;童菊芸;陈镇荣;郑俏伟;王千菊 - 广东永顺生物制药股份有限公司
- 2023-09-05 - 2023-10-13 - C12N7/00
- 本发明属于生物技术领域，公开了一株禽腺病毒，分类名为Ⅰ群4型禽腺病毒FAdV‑YSHN（
- 一株猪δ冠状病毒传代致弱毒株及其应用-202310864470.1
- 胡慧;魏战勇;张云飞;张越;靳晓慧;祖少坡;夏璐;袁晋 - 河南农业大学
- 2023-07-14 - 2023-10-13 - C12N7/00
- 本发明公开了一株猪δ冠状病毒传代致弱毒株及其应用，属于生物医药技术领域。该弱毒株的保藏编号为CCTCC NO:V202363。该弱毒株是在猪肾上皮细胞上传代后经克隆纯化而得的传代致弱毒株。该毒株随着体外传代次数的增加，其在细胞上的敏感性和适应性逐渐增强，而其毒力显著降低，感染新生仔猪无明显临床症状。经序列分析，与强毒株相比，致弱毒株存在多个基因突变，且集中在S1蛋白。蛋白结构预测结果表明，部分突变可能改变了S蛋白的结构进而影响其致病性。致弱毒株和强毒株对仔猪肠道菌群的影响具有显著性差异，致弱毒株的感染会引起大量有益菌的丰度增加。该弱毒株生物安全风险较低，是具有较高安全性的疫苗候选弱毒株。
- 一种鲍曼不动杆菌噬菌体及其应用-202310554053.7
- 陈松建;张改;靳静;李振江;王书伟;刘肖;张杰;王山梅;陈欣欣;史学鹏 - 河南医学高等专科学校;希拓生物科技有限公司
- 2023-05-17 - 2023-10-13 - C12N7/00
- 本发明公开了一种鲍曼不动杆菌噬菌体及其应用，保藏号为CCTCC M2023077，分类命名：鲍曼不动杆菌噬菌体，保藏日期为2023年1月12日。经测序，其基因组序列为SEQ ID NO.1。具有较广的鲍曼不动杆菌宿主谱；具有良好的安全性；在体内对耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌具有较强的抗菌作用；可用于治疗耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌的肺部感染；可显著杀死肺组织中耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌；可明显减轻急性耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌感染后的炎症反应。
- H9亚型禽流感病毒毒株及其培养方法-202311146428.2
- 张茜;宋新宇;车艳杰;李守军;高冉;张立霞;段进坤;何卓琳;蔡天宁;徐雷 - 天津瑞普生物技术股份有限公司
- 2023-09-07 - 2023-10-13 - C12N7/00
- 本发明提供了一种H9亚型禽流感病毒FJ株，其保藏编号为CCTCC NO:V202312，其HA基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，还提供了一种H9亚型禽流感病毒FJ株细胞悬浮培养工艺研究及其应用。本发明提供的H9亚型禽流感病毒FJ株，滴度高，传代稳定，免疫原性良好。利用该毒株制备的灭活疫苗，对新型H9亚型禽流感流行野毒株提供有效的交叉保护。本发明实现了H9亚型禽流感病毒FJ株的悬浮细胞培养，培养方法简单高效，成本低，适用于大规模工业化培养。
- 一种蚜虫浓核病毒SmDV-Yuanyang在蚜虫防治中的应用-202210472636.0
- 李彤;蒋月丽;徐永伟;巩中军;武予清;苗进;段云;鲁瑞杰 - 河南省农业科学院植物保护研究所
- 2022-04-29 - 2023-10-13 - C12N7/00
- 本发明提供了一种蚜虫浓核病毒SmDV‑Yuanyang在蚜虫防治中的应用，属于生防病毒技术领域。本发明从荻草谷网蚜种群中鉴定的一种新型蚜虫浓核病毒株，通过全基因测序、基因组结构的分析以及系统发育树构建，本发明分离的病毒鉴定为双义浓核病毒属(Ambidensovirus)，保藏编号为CCTCCNO:V202231。蚜虫转染试验表明，荻草谷网蚜浓核病毒感染可以显著降低荻草谷网蚜的适合度(总产子数和寿命)，并且可以通过麦苗进行传播。荻草谷网蚜浓核病毒是一种新型的潜在蚜虫的生防资源，为蚜虫防治药物提供了新思路。
- 一种全悬浮细胞培养生产猪伪狂犬病毒抗原的方法-201910376694.1
- 董彦鹏;肖澄;钱建宁;罗顺;姜平;缪芬芳;张业忻;车巧林;王嘉琪;胡芳;沈燕;胡静雅;王彦奇;柴玮迹;耿晓眉 - 江苏南农高科技股份有限公司;甘肃健顺生物科技有限公司
- 2019-05-07 - 2023-10-13 - C12N7/00
- 本发明提供了一种全悬浮细胞培养生产猪伪狂犬病毒抗原的方法，该方法可以大量降低生产成本，无需载体和血清，生产过程更为简便，无需细胞驯化或换液操作，且该工艺占地小，可迅速进行规模化生产，对环境要求较低，自动化程度高，人工成本少，生产批间差异小，质量稳定易于控制，可明显提高产品的产量及质量。一种全悬浮细胞培养生产猪伪狂犬病毒抗原的方法，包括如下步骤：(1)种子细胞的培养及传代；(2)种子细胞的接毒；(3)病毒的收获和含量测定；其中，步骤(1)中，种子细胞为PK‑15B1，步骤(2)中，种毒为PRV ZJ011G，各步骤培养采用无血清细胞培养基CD PK15 259。
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