[发明专利]一种通过基因编辑创制油菜雄性不育新种质的方法及应用

说明书

本发明提供了一种通过基因编辑技术创制雄性不育系的方法和应用。该方法通过对MS5基因的保守结构域进行基因编辑敲除，使得MS5基因功能丧失或者产生功能获得突变，从而形成隐性或显性细胞核雄性不育系。本发明制备的雄性不育系与正常材料相比，除了育性差异外，没有其他可见的表型变化；如果应用于杂种优势利用或者群体改良，将极大地提高育种效率，降低人工成本，在农业生产中具有重要的意义。

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体而言，涉及利用CRISPR/Cas9系统对甘蓝型油菜MS5基因进行编辑，进而获得不同类型细胞核雄性不育系。

背景技术

油脂是人类赖以生存的三大类主要营养素之一，维护食用油供给安全是国家安全战略的核心之一。杂交种的推广和杂种优势的利用是提高油菜产量的有效途径之一(傅廷栋.中国油菜生产和品种改良的现状与前景.安徽农学通报，2000，6(1)：2-8)。而安全有效的授粉控制系统是油菜杂交种生产的重要前提。

目前，油菜中常用的授粉控制系统主要有：细胞核雄性不育，细胞质雄性不育，自交不亲和，人工创制的转基因核不育系统以及化学杀雄等。其中，显性细胞核雄性不育系统表现出花粉败育稳定彻底、无胞质负效应且细胞质来源丰富、不育性状容易转育、容易实现杂交种的“三系化”制种过程等优点，因而得到了育种家的青睐和国内外多家科研单位的积极研究。Yi3A是我国发现、报道的原生型细胞核雄性不育类型(李树林，周熙荣.显性核不育油菜的遗传与利用.作物研究，1990，4：27-32)，基于该不育突变材料曾成功的选育出在生产上商业化推广的品种。遗传分析显示，显性核不育系统的育性受到同一位点的三个复等位基因控制，分别为MS5^a(恢复基因)，MS5^b(不育基因)和MS5^c(正常可育或临保系基因)，且三者之间的显隐性关系为MS5^a＞MS5^b＞MS5^c(Lu W，Liu J，Xin Q，Wan L，Hong D，Yang G.Atriallelic genetic male sterility locus in Brassica napus：an integrativestrategy for its physical mapping and possible local chromosome evolutionaround it.Annals of botdny，2013，111(2)：305-315)。因此，在MS5^b处于纯合状态或者基因型为MS5^bMS5^c的杂合状态时，单株表现为雄性不育；而MS5^a基因型存在时，或者MS5^c处于纯合时，单株则表现为可育。通过图位克隆和转基因功能验证，已成功分离获得恢复基因MS5^a(BnaA08g25920D)(Xin，Q.，Shen，Y.，Li，X.，Lu，W.，Wang，X.，Han，X.，Dong，F.，Wan，L.，Yang，G.，and Hong，D.(2016).MS5 mediates early meiotic progression and itsnatural variants may have applications for hybrid production in Brassicanapus.The Plant Cell 28：1263-1278.)。

我们在前期研究中已获得MS5^b区段的序列，但其造成减数分裂异常的功能区段和分子机理一直未得到解析，因此，解析MS5^b不育基因的功能，通过编辑MS5不同结构域，根据需要创制隐性核不育和显性核不育系用于甘蓝型油菜、白菜和甘蓝等芸薹属作物的杂种优势利用和群体改良，将极大地提高不育系选育效率，为作物育种提供创新高效的新途径。经检索国内外现有技术，尚未发现利用CRISPR/Cas9技术创造甘蓝型油菜雄性不育系的报道。

发明内容