[发明专利]一种通过基因编辑创制油菜雄性不育新种质的方法及应用

权利要求书

1.一种甘蓝型油菜雄性不育株系的创制方法，其特征在于，该方法采用CRISPR/Cas9或其它基因编辑系统，定点敲除MS5基因或者MS5基因MS5 superfamily结构域，进而使得所述基因对应的蛋白发生功能缺失。

2.根据权利要求1所述甘蓝型油菜雄性不育株系的创制方法，其特征在于，该方法的具体步骤为：

步骤1、选择MS5基因的两个gRNA靶点，两个所述gRNA靶点为位于coiled coil结构域的S1，以及位于MS5 superfamily结构域的S2，所述靶点S1的序列如SEQ ID NO:1所示，所述靶点S2的序列如SEQ ID NO:2所示，并合成构建载体所需的引物；

步骤2、构建双靶点CRISPR/Cas9基因编辑载体；

步骤3、抽提质粒，转化农杆菌；

步骤4、通过农杆菌介导的方式将载体转化油菜下胚轴，在转基因后代中筛选MS5基因突变的植株，从而获得甘蓝型油菜雄性不育株系。

3.根据权利要求2所述甘蓝型油菜雄性不育株系的创制方法，其特征在于，步骤1中所述引物的序列分别如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示。

4.根据权利要求2所述甘蓝型油菜雄性不育株系的创制方法，其特征在于，所述步骤2中双靶点CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建步骤为：

步骤2.1、以SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示的序列为引物，以pCBC-DT1T2质粒为模板，采用高保真酶进行PCR扩增，琼脂糖电泳后切胶并纯化回收PCR产物；

步骤2.2、用BsaI酶切同时用T4 DNA连接酶对步骤2.1回收的PCR产物与CRISPR/Cas9载体组装为终载体；

步骤2.3、将终载体转化大肠杆菌感受态细胞，抗性筛选，菌落PCR鉴定，一代测序确定载体序列的准确性。

5.根据权利要求2所述甘蓝型油菜雄性不育株系的创制方法，其特征在于，所述步骤3中的农杆菌为农杆菌GV3101。

6.根据权利要求2所述甘蓝型油菜雄性不育株系的创制方法，其特征在于，所述步骤4中在转基因后代中筛选MS5基因突变的植株时，首先利用引物S-MS5-L/S-MS5-R对包含两个靶标位点的区域进行扩增，然后再利用扩增片段内部的引物SS-MS5-1和SS-MS5-2通过一代测序方法检测两个靶点位点的序列，确定靶标位点是否被编辑；所述的引物S-MS5-L的序列如SEQ ID NO:7所示，所述的引物S-MS5-R的序列如SEQ ID NO:8所示，所述的引物SS-MS5-1的序列如SEQ ID NO:9所示，所述的引物SS-MS5-2的序列如SEQ ID NO:10所示。

7.根据权利要求1-6任一项所述甘蓝型油菜雄性不育株系的创制方法，其特征在于，所述的甘蓝型油菜材料选自基因型为MS5^cMS5^c的Westar和/或基因型为MS5^aMS5^a的Y127。

8.MS5基因在创制油菜雄性不育系中的应用，所述的应用是：采用CRISPR/Cas9系统敲除和改变MS5基因，进而获得油菜雄性不育系。

9.根据权利要求8所述MS5基因在创制油菜雄性不育系中的应用，其特征在于，所述的MS5基因为MS5^a或MS5^c。