[发明专利]一种microRNA检测试剂盒和多生物素分子检测microRNA的方法

说明书

本发明涉及一种microRNA检测试剂盒和多生物素分子检测microRNA的方法。本发明将待测microRNA分子与放大桥分子、捕获桥分子一起加入到固相上进行杂交，通过捕获桥分子分别与microRNA分子和捕获分子的部分杂交，将microRNA分子捕获到固相上，而放大桥分子的一端与靶分子杂交识别，另一端与下一步加入的放大分子结合，放大分子上连接的多个生物素分子再与标记物如辣根过氧化物酶结合，最终实现microRNA分子的检测过程。本发明方法十分灵敏，而且是通过信号放大而不是基于PCR的模板扩增技术来实现对核酸的检测，从而避免PCR固有的污染问题。

本发明是针对2013年07月30日提交的发明专利申请《一种microRNA检测试剂盒和多生物素分子检测microRNA的方法》(申请号：201310324829.2)提出的分案申请。

技术领域

本发明涉及一种microRNA检测试剂盒和多生物素分子检测microRNA的方法，属于生物检测领域。

背景技术

microRNA是近年来在多种真核细胞及病毒中发现的一类来源于内源性染色体上的非编码单链RNA，长度约为22(18～25)个核苷酸的短序列，在进化上具有高度的保守性。它们基于与靶mRNA的序列互补，能够通过与靶mRNA特异性的碱基互补配对，引起靶mRNA降解或者抑制其翻译，从而对基因进行转录后的表达调控。microRNA广泛地存在于多种真核生物中，从低等生物到人类都有其存在的痕迹。其生物学特性主要表现为：高度保守性，时序表达特异性和组织表达特异性。尽管对miRNA功能的认识不够完全，但miRNA在许多生物过程中起关键作用，包括发育、细胞分化、增殖、凋亡等，并在许多疾病发生过程中，如肺癌、白血病等起作用。近期的研究发现人血清中稳定存在一定水平的miRNA，并且血清miRNA表达谱的变化与多种肿瘤的发生、发展具有明确的相关性,说明血清miRNA可以作为肿瘤临床诊断和预后评估的分子标志物。

目前microRNA在疾病控制领域的应用主要集中在肿瘤的诊断与治疗、自身免疫疾病、抗病毒和新药研发等方面。迄今已在人类基因组中注释了500多种microRNA。借助进一步发展的分子检测技术，将会有更深入的研究。这将不断的增加人们对miRNA的认识，为更深入的发展疾病治疗方法及新药研制打下良好的基础。

microRNA由于同源性高，长度较短，细胞或组织内含量低，针对它的高灵敏高选择性检测方法仍然有待进一步完善。目前常见的microRNA检测主要有：Nothern Blot，基于酶反应的扩增方法，芯片技术，高通量测序等。

Northern Blot是验证和确认miRNA的传统方法，但该方法操作复杂、工作流程长，同时需要的样本量大，并且灵敏度有限。芯片技术(microarray)检测方法可以实现快速、高通量的检测。目前已有多种类型的miRNA检测芯片可以选用。但是芯片检测方法的重现性和准确性比较差，一般多用于初筛，对获得的结果通常需要采用Northern blot和实时定量PCR进行验证，不适用于临床样本的高通量检测。

荧光定量PCR方法无疑是目前检测miRNA表达的最常用方法。常规的荧光定量检测方法中有基于茎-环的RT-PCR方法(stem-loop RT-PCR)以及基于polyA加尾的RT-PCR方法。虽然这两种方法有较好的灵敏度和特异性，但都有各自不足的地方。对于stem-loop RT-PCR，针对一个microRNA的检测需特异对应一个茎-环状结构的反转引物，因此在同时检测多种microRNA时，需要对该样品进行多次反转；并且合成茎环引物的价格较高。而对于polyA加尾的RT-PCR方法，则需要在反转录前进行末端Poly(A)加尾。这两种检测前的预处理使得这两种方法操作复杂且费用昂贵。此外，荧光定量PCR需要较昂贵的仪器，对于实验条件要求较高，容易污染出现假阳性等。针对PCR的不足，其他核酸扩增方法，如滚环扩增，恒温指数扩增等均发展用来检测microRNA，这些方法各有优势，但是复杂的标记、探针设计及仪器的要求等仍然限制着它们的应用。