[发明专利]一种大肠杆菌DH5α高效感受态细胞的制备方法

权利要求书

1.一种大肠杆菌DH5α高效感受态细胞的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

步骤一：将-80℃～-70℃下冷冻保藏的大肠杆菌置于超净台上，并在室温环境下融化大肠杆菌；然后将融化的大肠杆菌在第一块不含抗性的LB固体培养基平板上涂板；再在37℃的恒温培养箱中下培养，直至在第一块不含抗性的LB固体培养基平板上长出大肠杆菌的单克隆的菌落；

步骤二：在第一块不含抗性的LB固体培养基平板上长出大肠杆菌的单克隆的菌落后，挑取大肠杆菌的单克隆的菌落，并在第二块不含抗性的LB固体培养基平板上划线分离；然后在37℃的恒温培养箱中下培养，直至划线处长出菌苔；接着挑取一条菌苔，并放入装有10ml～15ml的灭菌LB液体培养基的第一容器中；再将第一容器置于摇床上，在37℃下以210rpm～240rpm的速度振荡，直至扩大培养得到的第一混合菌液的OD₆₀₀值为1.5～2.2；

步骤三：将第一混合菌液转移至装有灭菌LB液体培养基的第二容器中，其中，第一混合菌液与灭菌LB液体培养基的体积比为1:20；再将第二容器置于摇床上，在37℃下并以210rpm～240rpm的速度振荡，直至扩大培养得到的第二混合菌液的OD₆₀₀值为0.6～0.8；

步骤四：将第二混合菌液倒入预冷的离心管中；然后将离心管置于预冷的离心机上，以3500rpm～4000rpm的速度离心处理6～10分钟后，再去掉上清，第一次收集大肠杆菌；

步骤五：用预冷的浓度为0.1mol/L的CaCl₂溶液重悬第一次收集的大肠杆菌，得到第一重悬液；再对第一重悬液冰浴处理10～15分钟；其中，CaCl₂溶液与倒入预冷的离心管中的第二混合菌液中含有的灭菌LB液体培养基的体积比为1:30；

步骤六：将第一重悬液倒入预冷的离心管中；然后将离心管置于预冷的离心机上，以3000rpm～3500rpm的速度离心处理5～10分钟后，再去掉上清，第二次收集大肠杆菌；

步骤七：用预冷的浓度为0.1mol/L的CaCl₂溶液重悬第二次收集的大肠杆菌，得到第二重悬液；再对第二重悬液冰浴处理30～40分钟；其中，CaCl₂溶液与倒入预冷的离心管中的第二混合菌液中含有的灭菌LB液体培养基的体积比为1:30；

步骤八：将第二重悬液倒入预冷的离心管中；然后将离心管置于预冷的离心机上，以3000rpm～3500rpm的速度离心处理5～10分钟后，再去掉上清，第三次收集大肠杆菌；

步骤九：用预冷的浓度为0.1mol/L的CaCl₂溶液重悬第三次收集的大肠杆菌，得到第三重悬液，第三重悬液中的大肠杆菌即为大肠杆菌感受态细胞；其中，CaCl₂溶液与倒入预冷的离心管中的第二混合菌液中含有的灭菌LB液体培养基的体积比为1:30；

所述的步骤五、所述的步骤七和所述的步骤九中的CaCl₂溶液的制备过程为：每制备1L的CaCl₂溶液，将11.1g的CaCl₂溶解于800mL的超纯水中，加入150mL的甘油，加入超纯水定容至1L，得到CaCl₂溶液；然后利用高压蒸汽灭菌法对CaCl₂溶液在121℃高温下灭菌处理30分钟，并在灭菌的CaCl₂溶液冷却后在3℃～5℃下保存。

2.根据权利要求1所述的一种大肠杆菌DH5α高效感受态细胞的制备方法，其特征在于所述的步骤一中的第一块不含抗性的LB固体培养基平板和所述的步骤二中的第二块不含抗性的LB固体培养基平板的制备过程相同，具体为：

a1、制备LB固体培养基：每制备1L的LB固体培养基，将10g的胰蛋白胨、5g的酵母提取物、10g的NaCl和20g的琼脂粉溶解在800mL的超纯水中，调节pH值至7.0，加入超纯水定容至1L；

a2、利用高压蒸汽灭菌法对LB固体培养基在121℃高温下灭菌处理30分钟；然后将灭菌后的LB固体培养基置于水浴锅中冷却至45℃～50℃，得到融化的LB固体培养基，冷却过程中避免LB固体培养基局部凝固；

a3、在通风无菌环境下，将融化的LB固体培养基倒入无菌培养皿中，并立即盖上皿盖；再摇匀无菌培养皿中的融化的LB固体培养基，待融化的LB固体培养基冷却凝固后即得到不含抗性的LB固体培养基平板。