[发明专利]一种以聚多巴胺-磁性Fe3O4纳米粒子固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶的方法

说明书

本发明公开了一种以聚多巴胺‑磁性Fe₃O₄纳米粒子固定化D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶的方法，属于食品加工技术领域。本发明步骤是：制备D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶和聚多巴胺‑磁性Fe₃O₄纳米粒子，再以聚多巴胺‑磁性Fe₃O₄纳米粒子固定化D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶。聚多巴胺‑磁性Fe₃O₄纳米粒子既具有强烈的磁响应性，在外加磁场的作用下能够有效被磁力控制，还能通过聚多巴胺表面的高活性酚羟基等功能基团增强固定化的效果，提高载体的稳定性和酶的负载量，固定化酶的酶活力可达450.45U/g载体以上。

技术领域

本发明涉及一种以聚多巴胺-磁性Fe₃O₄纳米粒子固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶的方法，属于食品加工技术领域。

背景技术

传统的甜味剂如蔗糖热量高，过多的摄入会导致糖尿病、肥胖和心血管疾病等慢性病的发生，因此开发新型的低热量功能性甜味剂已经成为国际食品科学的研究热点。目前，木糖醇、低聚果糖、赤藓糖醇等功能性甜味剂已经在发达国家被广泛应用，但由于在口感和甜度等方面与蔗糖存在一些差距，所以不能完全取代蔗糖。D-阿洛酮糖作为稀少糖的一种，其甜度是蔗糖的70％左右，几乎不含热量。此外，D-阿洛酮糖具有葡萄糖和果糖所没有的生理功能，如在吃饭时食用D-阿洛酮糖，可以很好地抑制血糖上升。D-阿洛酮糖还可以防龋齿、预防和改善糖尿病以及抑制体内脂肪的累积。美国食品药品监督管理局于2014年正式批准D- 阿洛酮糖为一般公认安全(Generally Recognized as Safe，GRAS)，允许其应用于食品、膳食补充剂以及医药制剂中。

D-阿洛酮糖又被称为D-核糖-2-己酮糖，是D-果糖C-3位上的差向异构体。它在自然界中存在的含量极少，而化学合成法存在纯化步骤复杂、副产物多、污染严重等诸多问题，因此具有高度的专一性(反应专一性和底物专一性)的生物催化法合成D-阿洛酮糖引起了广泛的关注。其中D-阿洛酮糖3-差向异构酶(D-psicose 3-epimerase，DPEase，EC5.1.3.30)可实现D-果糖和D-阿洛酮糖之间的相互转化。

由于固定化酶易于从反应溶液中分离出来，可被重复使用，生产成本低，过敏性风险低，稳定性较游离酶具有明显的优势，对绿色和可持续产品的制造环境具有不可或缺的重要性，故被广泛应用于食品工业生产中。使用固定化酶技术时，固定化酶与酶促反应混合物的有效分离是需要克服的关键难题。磁性纳米粒子具备表面效应、小尺寸效应、量子尺寸效应和宏观量子隧道效应四项基本纳米粒子效应以及超顺磁性、高矫顽力、低居里温度和高磁化率等特殊的磁学性质，意味着这种材料比表面积大，颗粒表面存在羟基，易与酶分子产生较强的键合作用，低孔隙率和优异的机械稳定性有助于减少空间位阻，这些特征对于开发稳定的酶- 基质催化体系非常重要。Fe₃O₄磁性纳米粒子因比表面积大引发的高表面能而倾向于出现团聚现象，化学活性高、易氧化等特征会导致磁性和分散性的丧失，造成磁分离效率降低，影响固定化的吸附效果。因此，利用一些方法来帮助改善这些缺陷，应用改善后的固定化酶法生产功能广泛的有益物质比如D-阿洛酮糖，对于固定化酶的进一步应用有着重要的意义。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶的方法，是以聚多巴胺- 磁性Fe₃O₄纳米粒子为载体，先制备D-阿洛酮糖3-差向异构酶和聚多巴胺-磁性Fe₃O₄纳米粒子，再用聚多巴胺-磁性Fe₃O₄纳米粒子固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶。

在本发明的一种实施方式中，所述聚多巴胺-磁性Fe₃O₄纳米粒子固定化D-阿洛酮糖3- 差向异构酶的具体步骤包括：