[发明专利]一种大肠杆菌菌株的制备方法

说明书

本发明公开了一种大肠杆菌菌株的制备方法，所述方法包括以下步骤：出发菌的活化，NTG诱变处理，产醇途径相关基因的转入，筛选目标突变株，本发明通过NTG诱变的方法对大肠杆菌J16进行多轮突变制作突变库，利用含有单一氨基酸的培养基进行筛选，在该过程中还加入大肠杆菌产醇途径相关基因leud，kivd和yqhd，最终获得的N65菌株能够利用L‑丙氨酸、L‑丝氨酸、L‑苏氨酸、L‑色氨酸、L‑甲硫氨酸、L‑赖氨酸、L‑苯丙氨酸、L‑谷氨酰胺、L‑谷氨酸和L‑组氨酸作为唯一碳源进行生长。

技术领域

本发明涉及大肠杆菌菌株的制备技术领域，特别涉及一种大肠杆菌菌株的制备方法。

背景技术

蛋白质水解物是肽和氨基酸的混合物，在转化为生物燃料或化学品之前，它们的碳骨架必须通过脱氨、转氨或脱氢的酶反应从氨基中释放出来。然而，蛋白质水解产物的脱氨反应受到热力学可逆性和生物调节的双重限制。在自然界中，为了最大化养分的利用效率，微生物倾向于以氨基酸为单元将其再次合成为蛋白质，微生物缺乏多种氨基酸的降解途径。

为了使工程菌株能够将单一氨基酸或者蛋白质(20种氨基酸的混合物)定向转化为某一种或几种高附加值的生物产品，可能通过对代谢动力和生物调节进行适当地重组，使一些氨基酸可以直接脱氨基为α-酮酸,它可以通过具有广泛底物特异性的α-酮酸脱羧酶转化为许多化学物质,如醛,然后通过醇脱氢酶转化为醇类，其他氨基酸可以脱氨基成为三羧酸循环的中间体,其可以通过糖异生酶如苹果酸酶或磷酸烯醇丙酮酸羧激酶导向生成丙酮酸(一种主要的代谢中间体)。因此通过建立突变库和定向筛选获得能够利用单一氨基酸生长特性的大肠杆菌菌株，可以实现利用其代谢通路高效的将蛋白质降解所产生的碳骨架转化为高附加值产品的目标。目前，用于L-氨基酸微生物发酵法生产的微生物菌株多是使用氨基酸类似物进行反复筛选得到。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种大肠杆菌菌株的制备方法，以解决现有技术中微生物无法以单一氨基酸作为唯一碳源进行生长的问题。

为了解决上述技术问题，本发明的技术方案为：

一种大肠杆菌菌株的制备方法，包括以下步骤：

步骤1、出发菌的活化：以实验室保藏的大肠杆菌J16作为出发菌，将所述出发菌在固体培养基中划线，并在30℃-37℃的环境下培养出单菌落，将所述单菌落在液体培养基中培养，获得活化的菌体；

步骤2、NTG诱变处理：将涂布有菌体液的无菌载片置于处理源下进行诱变处理获得突变库，

所述菌体液包括活化的菌体和浓度为20％的甘油，且所述活化的菌体与所述浓度为20％的甘油的体积比为1:1；

步骤3、选择步骤2中获得的突变库中的多个单菌落涂布于筛选培养基上培养，选择能够正常生长的菌株作为目标突变株；

步骤4、产醇途径相关基因的转入：将leud，kivd和yqhd基因转入到步骤2获得的目标突变株中，得到诱变菌株；

步骤5、将步骤4中得到的目标突变株重复步骤2-4至少两次获得大肠杆菌诱变菌株N65。

可选的：所述固体培养基为LB固体培养基，所述液体培养基为LB液体培养基。

可选的：所述筛选培养基包括不含NH₄Cl的M9液体培养基中添加了单一的L-氨基酸和氨基酸类似物的培养基。

可选的：所述L-氨基酸包括20种天然氨基酸中的一种，所述氨基酸类似物包括正缬氨酸。