[发明专利]重组修饰的猪传染性胃肠炎病毒弱毒株及其应用

说明书

本发明涉及猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)弱毒株的重组及表达。由于不同病毒株之间的序列存在特异性，本发明以TGEV流行弱毒株H165为研究对象，以BAC载体pBeloBAC11为基本骨架，构建TGEV H165株感染性克隆，在感染性克隆的基础上，构建表达外源基因的重组质粒，获得了重组TGEV‑H165病毒。

技术领域

本发明涉及病毒重组领域，尤其涉及猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)弱毒株的重组及表达。

背景技术

猪传染性胃肠炎(Transmissible gastroenteritis，TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)引起的猪的一种急性高度接触性传播的肠道疾病，其临床主要特征是呕吐、水样腹泻、脱水和哺乳仔猪的高死亡率。该病于1933年首次在美国的伊利诺斯州发生，随后在全美国流行。1946年，Doyle等将该病的病原体确定为病毒，并作了详细报告。20世纪80-90年代，该病在全球范围内广泛流行，给各国的养猪业带来了巨大的经济损失。我国最早于1956年在广东省首次报道该病的发生，此后在其他省市均有报道，给我国养猪业造成了重大的经济损失。

TGE的发生和流行具有明显的季节性，以冬春寒冷季节发生较为严重，发病高峰期为1～2月份。流行特点主要分为流行性、地方流行性和周期性地方流行性。猪群密集的猪舍发病率高，老疫区呈地方流行性或周期性流行，新疫区呈流行性。病毒可以通过猪只的直接接触进行传播，也可通过呼吸道传播、母猪乳汁传播。病猪和带毒猪是主要的传染源，鼻分泌物、呼出气体、乳汁、呕吐物和粪便是它们主要的排毒途径，通过污染空气、饲料、饮水和用具等将病毒传染给易感猪。

TGEV是尼多目、冠状病毒科、冠状病毒亚科、α-冠状病毒属的重要成员，是一种单股正链RNA病毒，其基因组不分节段，大小约为28kb，5'端含有帽子结构，3'端含有Poly A结构；含有9个开放阅读框(Open reading frame,ORF)，即ORFla、ORF1b、ORF2、ORF3a、ORF3b、ORF4、ORF5、ORF6和ORF7，其中ORF2、ORF4、ORF5、ORF6分别编码纤突(Spike,S)蛋白、小膜(Envelope,E)蛋白、膜蛋白(Membrane,M)、核衣壳(Nucleocapsid,N)蛋白四种结构蛋白，ORFla、ORF1b编码复制酶蛋白，ORF3a、ORF3b和ORF7编码辅助蛋白p3a、p3b和p7。9个ORF在基因组中的顺序为5'-ORF(1a/1b)-S-3a-3b-sM-M-N-ORF7-3'，每个相邻两个基因之间的间隔有1～15个碱基，每个间隔内均有转录起始信号序列5'AA(UU)CUAAAC3'。TGEV主要感染哺乳仔猪的小肠上皮细胞，使得小肠上皮细胞很快死亡脱落，由于哺乳仔猪小肠上皮细胞更新的较慢，从而导致仔猪发生腹泻，严重时表现为水样腹泻。另外，该病毒变异毒株-猪呼吸道冠状病毒也可以感染肺上皮细胞，主要引起猪肺部疾病。