[发明专利]一种大豆结瘤中后期调控基因GmRSD及其应用方法

说明书

本发明公开一种大豆结瘤中后期调控基因GmRSD的应用方法，先构建含有SEQ IDNO：1所示核甘酸序列的过表达载体，然后利用此过表达载体构建转化体，再利用所得转化体侵染受体大豆根系，筛选阳性植株，获得与正常大豆所相比具有高结瘤固氮能力的转基因大豆，过表达载体以pEGAD为骨架载体，通过EcorR I和HindIII酶切后进行目的基因片段与骨架载体的连接，完成过表达载体的构建，利用过表达载体转化农杆菌获得转化体，然后再利用农杆菌K599介导的毛状根转化法获得转基因植物，筛选阳性植株得到与正常植物相比具有高结瘤固氮能力的转基因植物。本发明构建的过表达载体转化受体大豆植株获得转基因植物，能够显著提高大豆的结瘤固氮能力，对提高大豆产量具有重大的实际意义。

技术领域

本发明基因工程技术领域，具体涉及一种大豆结瘤中后期调控基因GmRSD 及其应用方法。

背景技术

大豆是高油、高蛋白作物，是非常重要的植物油和植物蛋白来源，在世界农业生产及农业经济中占有举足轻重的地位。大豆由于具有共生固氮功能，被认为是养地作物，氮对大豆的生长发育、产量和品质的影响非常大。有研究表明每亩大豆可以固定8公斤氮素，相当于每亩施用18公斤尿素，可以说大豆是地球上最大规模的天然氮肥合成工厂之一。因此发展大豆生产，充分利用大豆的共生固氮功能合成氮肥，对促进用地养地相结合，实现农业的可持续性生产和良性循环具有重要意义。

固氮效率受共生体系形成机制的影响，主要限制于大豆和根瘤菌的高效识别互作、足够有效的根瘤及成熟根瘤的高固氮能力。由于这三个关键过程受多因素影响，导致对大豆共生固氮调控的遗传机制了解甚少。因此，解析大豆高效共生固氮分子调控机制变得异常迫切，将对通过分子设计培育高效固氮大豆新品种具有重大的推动作用。

大豆根瘤数量与固氮效率两个性状是受多基因调控的典型的数量性状。目前，已经在大豆中克隆到结瘤因子的关键受体，找到了结瘤基因、受体激酶、肽类激素等一些在结瘤信号传导途径中的分子组分。阐明了部分基因的功能及作用机理，明晰了参与共生固氮的途径及部分节点，但是仍涉及许多未知的基因及节点，尤其是一些关键节点基因，亟待补充和完善。

发明内容

现有关于根瘤发育调控基因，多为早期调控基因，早期植株固氮能力较弱，氮素来源主要为根系从土壤吸收，而结瘤中后期共生固氮能力增强，植物所需氮素主要来源于共生固氮。本发明的目的是提供一种大豆结瘤中后期调控基因及其应用，该基因对高效共生固氮的贡献更大。

本发明是通过以下技术方案实现的。

一种大豆结瘤中后期调控基因GmRSD，其核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示，其正向扩增引物如序列表中的SEQ IDNO：2所示，其反向扩增引物如序列表中的 SEQ IDNO：3所示。

一种大豆结瘤中后期调控基因GmRSD的应用方法，包括以下操作步骤：

步骤一、提取大豆根瘤组织中总RNA；

步骤二、反转录PCR：在用焦碳酸二乙酯处理过的200μLPCR管中顺序加入5μL RNA和3μL oligo(dt)18；4μL dNTPs，65℃温育5min后迅速置于冰上冷却；

按以下顺序加入以下溶液：5倍M-MLV buffer 4μL，RNase inhibitor 1 μL，M-MLV1μL，0.1mol/L DTT 2μL；将上述反应液混匀，37℃反应30min；反应结束后，70℃处理10min灭活逆转录酶活性；反应合成的cDNA第一条链用作PCR反应模板；

步骤三、构建重组表达载体：