[发明专利]致病性念珠菌检测和鉴定方法

说明书

本发明提供了一种致病性念珠菌检测和鉴定方法，具体为：以致病性念珠菌分泌的特异性烯醇化酶作为检测靶标分子，采用基因工程和细胞工程技术生产念珠菌特异性烯醇化酶的单克隆抗体、标记物和包被载体，通过双抗体夹心法对致病性念珠菌进行检测和鉴定。本发明还提供了致病性念珠菌检测和鉴定卡及其制备方法。本发明首次实现了对致病性念珠菌分离鉴定，采用白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌和光滑念珠菌烯醇化酶的通用抗体作为标记物，使4种细菌能在同一检测和鉴定卡上检测出来，省去依次单一盲测确定何种菌株的感染的麻烦，方便经济。

技术领域

本发明涉及体外诊断技术领域，具体涉及致病性念珠菌检测和鉴定方法。

背景技术

念珠菌呈卵圆形，革兰染色阳性，是一种多形态的真菌，是人体最常见的寄生真菌，通常存在于正常人口腔、呼吸道、肠道及阴道，是常见的条件致病菌。常见致病性念珠菌为白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌和光滑念珠菌，其中白色念珠菌约占80％～90％，热带念珠菌、近平滑念珠菌和光滑念珠菌共占10％～20％。现阶段，体外诊断行业念珠菌的检测和鉴定主要依靠样本培养，而血液感染主要依靠血培养但检测率不足50％，有报道用检测试纸检测念珠菌的，但并不能对念珠菌进行鉴定，也未见有商品生产。由于人体寄生有多种类非致病性念珠菌，整体检测念珠菌会因非致病性念珠菌的干扰，造成假阳性诊断。

不同的致病念珠菌对抗真菌的敏感性不同，不鉴定时只能靠抗生素盲目治疗，耽误病情，现阶段念珠菌鉴定仍然依靠念珠菌显色平板培养，这种方法培养时间长，操作麻烦，导致临床上常难以早期诊断。因此迫切需要一种快速、敏感、高效的方法来进行辅助诊断。

烯醇化酶又称2-磷酸-D-甘油酸水解酶，是一个表达在念珠菌表面且具有极高的免疫原性的分子。烯醇化酶编码基因及蛋白结构具有高度保守性，念珠菌与其它几种酵母菌的相似性在90％以上。因此检测烯醇化酶可用来诊断致病性念珠菌，并将白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌和光滑念珠菌予以区分。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服念珠菌培养法检测鉴定耗时长，易污染之技术缺陷，提供一种念珠菌烯醇化酶的检测和鉴定方法，利用念珠菌烯醇化酶的特异性单克隆抗体，能够及时准确地判断待测样本中是否含有念珠菌烯醇化酶进而间接判断是否有念珠菌感染，并对常见的四种致病性念珠菌进行鉴别及定量分析。

本发明提供了一种致病性念珠菌检测和鉴定方法。具体技术方案如下：

一种致病性念珠菌检测和鉴定方法，具体为：以致病性念珠菌分泌的特异性烯醇化酶作为检测靶标分子，采用基因工程和细胞工程技术生产念珠菌特异性烯醇化酶的单克隆抗体、标记物和包被载体，通过双抗体夹心法对致病性念珠菌进行检测和鉴定。

进一步地，所述致病性念珠菌包括白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌和光滑念珠菌。

进一步地，所述念珠菌特异性烯醇化酶的单克隆抗体中白色念珠菌分泌的特异性烯醇化酶对应特异性单克隆抗体A，热带念珠菌分泌的特异性烯醇化酶对应特异性单克隆抗体B，近平滑念珠菌分泌的特异性烯醇化酶对应特异性单克隆抗体C，光滑念珠菌分泌的特异性烯醇化酶对应特异性单克隆抗体D，专一的单克隆抗体与其它烯醇化酶无交叉反应；所述白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌和光滑念珠菌分泌的特异性烯醇化酶都对应特异性单克隆抗体E。

一种致病性念珠菌检测和鉴定卡，包括卡壳和试纸条，卡壳分为上下两片，用于固定试纸条，上片有镂空的观察窗和加样孔，所述加样孔内侧用无纺布覆盖粘接；试纸条包括样本处理垫、标记物垫、硝酸纤维素膜和吸水纸。

进一步地，所述试纸条样本垫为玻璃纤维纸，用PBST-EDTA缓冲液浸润后烘干得到。

进一步地，所述试纸条标记物垫，使用标记物标记单克隆抗体E，均匀喷涂在硝酸纤维素膜上，烘干得到；所述标记物包括但不局限于胶体金、过氧化物酶、吖啶酯、碱性磷酸酶、乳胶微球或荧光物质。