[发明专利]一种鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF72蛋白重组杆状病毒表达载体及其制备方法

说明书

本发明提供了一种鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF72蛋白重组杆状病毒表达载体及其制备方法，其是以提取的CyHV‑2 cDNA为模板，扩增出ORF72基因，将扩增的ORF72基因连接至杆状病毒载体pFastBac HTA中，构建重组杆状病毒载体pFastBac HTA‑CyHV‑ORF72，转化至大肠杆菌感受态细胞DH10Bac中，获得重组穿梭杆粒rBacmid‑CyHV‑ORF72，鉴定正确后将其转染至Sf9昆虫细胞，获得重组杆状病毒，并将重组杆状病毒进行传代扩增，将高滴度的含有CyHV ORF72基因的杆状病毒接到sf9昆虫细胞中进行CyHV ORF72蛋白的真核表达。选用本发明方法构建鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF72蛋白重组杆状病毒表达载体，并利用重组杆状病毒表达系统在昆虫细胞中表达鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF72蛋白，为鲤疱疹病毒血清学ELISA检测方法的建立奠定了基础。

技术领域

本发明涉及生物技术中基因重组表达领域，特别涉及一种鲤疱疹病毒Ⅱ型 ORF72蛋白重组杆状病毒表达载体及其制备方法。

背景技术

鲫鱼是我国淡水养殖的常见鱼种，属于鲤形目(Cypriniformes)，鲤科(Cyprinidae)，鲫属(Carassius)。鲫鱼(Crucian carp)饲养成本低,养殖地域广, 在中国淡水养鱼上占有重要地位，其中主要养殖品种为异育银鲫(Carassius auratus gibelio)。异育银鲫具有生长快速、抗逆性强、肉质好的优点，深受人们的喜爱。然而，随着养殖规模的逐渐扩大、集约化程度的不断提高，异育银鲫的病害问题日益突出。2012年，江苏省盐城地区养殖的异育银鲫爆发了一种以“鳃出血”为主要症状的疾病，称为鲫造血器官坏死病(俗称“鳃出血病”)。该病具有发病急、传播快、死亡率高的特点，严重威胁我国异育银鲫养殖业发展。

研究发现，鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2，CyHV-2)是造成鲫造血器官坏死病的病原。该病毒隶属于疱疹病毒目(Herpesvirales)、鱼疱疹病毒科(Alloherpesviridae)、鲤疱疹病毒属(Cyprinivirus)，CyHV-2与分离自鲤科鱼类的另外两种病毒鲤疱疹毒1(Cyprinid herpesvirus 1,CyHV-1)和鲤疱疹病毒 3(Cyprinidherpesvirus 3,CyHV-3)亲缘关系较近，与沟鲇疱疹病毒(Ictalurid herpes-virus 1,IcHV-1)关系相对较远。CyHV-2具有鱼类疱疹病毒的一般特征。现已确认，鱼类疱疹病毒基因组含有12个核心ORF，这些编码蛋白在CyHV-1和 CyHV-3中均有分布，主要参与病毒复制、装配以及衣壳的形成等过程。其中 ORF72主要编码衣壳三聚体亚单位2，与衣壳蛋白的形成有关。

杆状病毒表达系统是以杆状病毒为外源基因载体，该真核表达系统的受体是昆虫细胞或活体昆虫。杆状病毒表达系统具有的相对于其他表达系统更为特殊的优势是作为表达载体的杆状病毒基因组可以容纳更多外源基因；在昆虫细胞中进行蛋白的表达，能够很好地加工修饰外源蛋白；杆状病毒一般只感染节肢动物，对人和牲畜没有迫害。杆状病毒表达系统，是一种公认的、高效率的真核表达系统，它能够对重组蛋白进行特定的翻译后修饰作用，表达产物的生物学活性十分接近于天然蛋白。

本发明通过构建含CyHV ORF72的重组杆状病毒载体，并利用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中表达了鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF72蛋白，为建立安全、可靠、适合推广的鲤疱疹病毒血清学检测方法奠定了基础。

发明内容

针对现有问题的不足，本发明的目的是提供一种鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF72蛋白重组杆状病毒表达载体及其制备方法。利用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中表达了鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF72蛋白，为建立安全、可靠、适合推广的鲤疱疹病毒血清学检测方法奠定了基础，对防止鲤疱疹病毒的传入和控制具有重要现实意义。

本发明解决其技术问题采用的技术方案是：

一种鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF72蛋白重组杆状病毒表达载体，该重组杆状病毒表达载体的核苷酸序列为SEQ ID NO：1。