[发明专利]恩夫韦肽的制备方法和应用

权利要求书

1.一种恩夫韦肽的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤S01.以氨基树脂为载体树脂，依次与恩夫韦肽第1个至第25个氨基酸对应的Fmoc-氨基酸进行偶联反应，得到全保护的多肽片段，酸解得到脱保护基的多肽片段SEQ ID NO：2；所述氨基树脂选自Rink Amide MBHA树脂，所述Rink Amide MBHA树脂的取代值为0.6mmol/g；

步骤S02.以羧基树脂为载体树脂，依次与恩夫韦肽第26个至第36个氨基酸对应的Fmoc-氨基酸进行偶联反应，偶联反应结束接入乙酰基，酸解切割，得到多肽片段SEQ IDNO：3；所述羧基树脂为二氯三苯甲基氯树脂，所述二氯三苯甲基氯树脂的取代值为0.6mmol/g；

步骤S03.将多肽片段SEQ ID NO：3与丙酮叉保护的水杨醛进行缩合反应，随后酸解脱除保护基，得到多肽片段SEQ ID NO：4；

步骤S04.将多肽片段SEQ ID NO：2与多肽片段SEQ ID NO：4溶于吡啶和醋酸的混合溶剂中进行丝氨酸多肽连接，经酸解，得到恩夫韦肽；

其中，所述偶联反应与缩合反应中，缩合剂选自2-(7-氮杂-1H-苯并三氮唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯，活化剂选自N,N-二异丙基乙胺，所述第1个至第25以及第26个至第36个氨基酸是指恩夫韦肽从CONH₂端顺次至Ac端的各个氨基酸；

SEQ ID NO：2为：

H₂N-SQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-CONH₂；

SEQ ID NO：3为：

AcHN-YTSLIHSLIEE—COOH；

SEQ ID NO：4为：

AcHN-YTSLIHSLIEE—COO—Ph—CHO；

步骤S05.将得到的所述恩夫韦肽溶解后，将pH调节至7.5并用滤膜滤过，得到的滤液经反相C18柱纯化，将所需要的组分收集浓缩，其中纯化流动相系统为0.05mol/L醋酸钠的水和乙腈系统；再以流动相系统为1％醋酸-乙腈系统换盐，将需要的组分收集浓缩，冻干得产品。

2.如权利要求1所述的恩夫韦肽的合成方法，其特征在于，步骤S01、步骤S02中的偶联反应中需加入缩合剂和活化剂，缩合剂和活化剂的加入量相等。

3.如权利要求1所述的恩夫韦肽的合成方法，其特征在于，步骤S03的缩合反应中，缩合试剂和活化试剂的用量相等；所述缩合试剂的摩尔用量为多肽片段SEQ ID NO：3摩尔数的3～6倍。

4.如权利要求1所述的恩夫韦肽的合成方法，其特征在于，步骤S01中，氨基酸为载体树脂的树脂固载量的总摩尔数的1.2～6倍；步骤S02中，氨基酸为载体树脂的树脂固载量的总摩尔数的1.2～6倍。

5.如权利要求1所述的恩夫韦肽的合成方法，其特征在于，步骤S01、步骤S03中酸解处理使用的酸解剂均为三氟乙酸、1,2-乙二硫醇和水的混合溶剂。

6.如权利要求1所述的恩夫韦肽的合成方法，其特征在于，步骤S02中酸解处理使用的酸解剂为1％三氟乙酸的二氯甲烷溶液；

步骤S04中酸解处理使用的酸解剂为95％三氟乙酸的水溶液。

7.如权利要求1所述的恩夫韦肽的合成方法，其特征在于，步骤S02中，接入乙酰基的方法为采用体积百分含量为5％乙酸酐、10％N-甲基吗啡啉、85％N,N-二甲基甲酰胺的溶液溶解偶联反应得到的产物。

8.如权利要求1所述的恩夫韦肽的合成方法，其特征在于，步骤S01、S02中偶联反应前需要对Fmoc-氨基酸进行去Fmoc保护处理，去Fmoc保护处理使用的溶液为体积分数为15～25％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液。