[发明专利]一种基于CsWAKL08超量表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法

说明书

本发明公开了一种基于CsWAKL08超量表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法，包括以下步骤：(1)克隆柑橘CsWAKL08基因编码序列，然后进行超量表达载体构建；(2)超量表达载体转化柑橘，得到转基因植株。该方法通过将一个与编码细胞壁关联的类受体激酶的基因过表达载体整合到柑橘中，有效提高柑橘对溃疡病的抗性。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种基于CsWAKL08超量表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法。

背景技术

柑橘是我国南方重要的果树作物，因其具有较高的食用价值和药用价值而受到人们的喜爱。柑橘是全球重要经济作物，主要种植在非洲(16.60％)，亚洲(52.90％)、美洲(24.50％)、欧洲和大洋洲(6％)(魏方林等，2008)。然而柑橘产业发展却饱受各种病害的困扰，其中柑橘溃疡病(Citrus bacterial canker，CBC)是阻碍柑橘产业发展最为严重的病害之一(胡军华等，2015)。我国广东、广西、福建、湖南等柑橘主产区受柑橘溃疡病侵害较为严重。全世界有30多个国家和地区将柑橘溃疡病列为重要的植物检疫对象。柑橘溃疡病是由黄单胞杆菌柑橘致病变种(Xanthomonas citri subsp.citri，Xcc)引起，起源于印度、爪哇等地(胡军华等，2015)。

溃疡病菌主要侵染柑橘叶片、枝梢、果实等，其中苗木、幼树受害较为严重。病树会出现落叶、枯梢、树势衰弱以及落果等现象，严重的影响了柑橘的产量和品质。病树的叶片发病初期表层出现浓黄色小圆斑，后期病变成淡褐色或褐色，最终形成火山口状灰白色凸起(何秀玲等，2007)。受到柑橘溃疡病危害的芸香科植物有几十种，其中绝大部分为经济栽培品种。有研究发现甜橙最易感病，其次是酸橙和柚类(袁承东等，1997；李敏等，2013)。

目前为控制柑橘溃疡病危害通常采取化学防治为主，生物防治为辅的综合防治策略。由于以上防治措施对环境不友好，且需要投入大量的人力、物力，亟待通过培育抗病新品种来减少溃疡病带来的损失(陈力等，2008；朱雪梅等，2017)。在抗病育种方面一代代柑橘人进行了长期杂交育种，但由于杂交育种周期长使得育种效率低。随着分子生物学的兴起，人们开始从抗病基因工程方向对病原菌本身和植物的抗病防卫反应进行研究。基因工程手段也在抗溃疡病研究中进行了尝试(贾瑞瑞等，2017；段敏杰等，2016)，获得了一些对溃疡病有抗性的转基因材料。陈善春等获得了对柑橘溃疡病有抗性的转柞蚕抗菌肽D基因的锦橙、新会橙、脐橙株系(陈善春等，1996)。外源基因NLS，chit42，Xa21和PthA在转移至冰糖橙，椪柑和甜橙后对柑橘溃疡病具有抗性(Mendes et al，2010；Yang et al，2011)。贾瑞瑞的研究发现CsBZIP40是响应柑橘溃疡病侵染的一个重要的转录因子，并且猜测是通过SA途径影响柑橘品种的抗性(贾瑞瑞等，2017)。CsLOB1基因作为溃疡病病原基因PthA的靶蛋白，被认为是是柑橘溃疡菌的感病因子，使得植物对溃疡病更为敏感(Li et al，2014)。Fuqua等发现由N-酰基高丝氨酸内酯(AHL)可作为诱导细菌群体感应系统的信号分子，并且参与到各种病原体的发病机制中(Fuqua et al，1994；Withers et al，2001)，之后他们将细菌中的水解酶转基因进入植物，发现植物对溃疡病的抵抗力更强(Zan et al，2011)。近年来，出现了使用基因敲除技术来防御溃疡病病原菌的方法，Peng等对柑橘溃疡病感病基因CsLOB1启动子进行CRISPR/Cas9靶向敲除从而获得了对柑橘溃疡病抗性提高的植株。