[发明专利]一种基于CsWAKL08超量表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法

权利要求书

1.一种基于CsWAKL08超量表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）克隆柑橘CsWAKL08基因编码序列，然后进行超量表达载体构建；

（2）超量表达载体转化柑橘，得到转基因植株；

CsWAKL08基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示。

2.根据权利要求1所述的一种基于CsWAKL08超量表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法，其特征在于，步骤（1）中，克隆CsWAKL08基因编码序列所采用的引物为OE-CsWAKL08-F和OE-CsWAKL08-R，核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。

3.根据权利要求1所述的一种基于CsWAKL08超量表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法，其特征在于，步骤（1）中，柑橘CsWAKL08基因编码序列的克隆方法为：提取柑橘总RNA，然后反转录为cDNA，最后采用高保真酶PCR扩增CsWAKL08基因编码序列DNA片段。

4.根据权利要求1所述的一种基于CsWAKL08超量表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法，其特征在于，步骤（1）中，超量表达载体构建方法为：以pLGNe为载体，利用EcoRI和KpnⅠ酶切目的片段后连接到同样酶切的载体上，构建出超量表达载体pLGNe-CsWAKL08。

5. 根据权利要求4所述的一种基于CsWAKL08超量表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法，其特征在于，pLGNe载体带有CaMV35S启动子和β-葡萄糖酸苷酶基因，分别具有SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。

6.根据权利要求1所述的一种基于CsWAKL08超量表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法，其特征在于，步骤（2）中，超量表达载体转化柑橘的方法为：超量表达载体通过电击法转化根癌农杆菌，再用根癌农杆菌介导转化柑橘外植体。

7.根据权利要求6所述的一种基于CsWAKL08超量表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法，其特征在于，遗传转化后的外植体细胞经离体培养、染色鉴定、嫁接后得到转基因植株。

8.根据权利要求1所述的一种基于CsWAKL08超量表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法，其特征在于，步骤（2）得到转基因植株后，对转基因植株进行抗性评价，判定CsWAKL08基因超量表达与柑橘溃疡病的相关性。

9.根据权利要求8所述的一种基于CsWAKL08超量表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法，其特征在于，对转基因植株进行抗性评价前，通过PCR验证转基因植株，采用的引物为ID-CsWAKL08-F和ID-CsWAKL08-R，ID-CsWAKL08-F是取自载体上CaMV 35S的一段序列，ID-CsWAKL08-R是根据基因尾部一段序列设计而成，核苷酸序列分别如SEQ ID NO：5和SEQ IDNO：6所示，阳性植株可以得到2688 bp的扩增片段。

10.根据权利要求9所述的一种基于CsWAKL08超量表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法，其特征在于，PCR验证后，利用实时荧光定量PCR进行CsWAKL08基因表达量检测，采用的引物为RT-CsWAKL08-F和RT-CsWAKL08-R，核苷酸序列分别如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示，实时荧光定量PCR内参为柑橘Actin基因，采用引物为RT-CsActin-F和RT-CsActin-R，核苷酸序列分别如SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示。