[发明专利]肝细胞生长因子的重组表达方法

说明书

本发明提供了一种肝细胞生长因子的重组表达方法，包括：分别构建表达肝细胞生长因子α链的质粒和表达肝细胞生长因子β链的质粒，使得α链和β链两条链在哺乳动物细胞中共表达，并且能够在哺乳动物细胞内自发形成二硫键，从而自然组装成完整的肝细胞生长因子并分泌至细胞培养的上清液中。这种表达肝细胞生长因子的方法，无需经过任何酶处理，即可一步获得具有生物活性的成熟肝细胞生长因子，避免了添加血清或蛋白酶容易带来的批次差异性大、供应不稳定以及安全性的问题。

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，特别涉及一种肝细胞生长因子的重组表达方法。

背景技术

肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor，HGF)被认为是血清中促进肝再生的生长因子。HGF是以无活性的酶原形式分泌至细胞外，随后被丝氨酸蛋白酶切割成成熟的异二聚体，此二聚体由二硫键连接的69kDaα-亚基和34kDaβ-亚基组成。HGF影响不同组织包括肝、肺、肾、肠、心血管系统的形态发生、细胞迁移、器官再生、肿瘤入侵。

在近期的研究中也揭示了HGF在不同疾病中潜在的药用价值，如肝纤维化和肝硬化、肾纤维化、肺纤维化、闭塞性动脉硬化等等。因此开发重组HGF对于医疗应用具有重要意义。然而，传统常用的大肠杆菌表达重组HGF，纯化时需经过变性复性过程，其过程较复杂不利于大规模生产，酵母表达的重组HGF其修饰程度并未完全接近于天然存在的HGF，其药效还未可知。另一方面，HGF重组质粒打进人体后，由于个体的差异，其表达也将存在差异，无法保证药效的一致性。而哺乳动物细胞表达的蛋白质，其修饰程度非常接近天然形式HGF，因此在哺乳动物细胞中进行HGF表达具有潜在的应用价值。

rhHGF根据HGF是否加工成熟可以进一步细分为初体rhHGF(rhHGF pro)和成熟的rhHGF(rhHGF mature)。理论上，rhHGF pro被注射到生物体内后有可能在血液中转化为具有生物活性的rhHGF mature，但由于生物体代谢的复杂性和个体的差异性，其转化效率会存在差异，若用于药物治疗可能会导致药效的不稳定性和延迟性。在体外，通过在细胞培养基中添加动物血清即可以提供HGF成熟所需的蛋白酶，rhHGF pro能够被转化为rhHGFmature，但动物血清在表达HGF时存在价格昂贵、批次差异性大、供应不稳定以及安全性等问题，不利于在大规模生产中使用。

发明内容

基于此，本发明的目的在于提供一种肝细胞生长因子的重组表达方法，实现在不添加动物血清的情况下，用动物细胞即可一步表达得到具有生物活性的rhHGF mature。

为实现上述目的，本发明具体技术方案如下：

一种肝细胞生长因子的重组表达方法，包括：分别构建表达肝细胞生长因子α链(α-chain)和表达肝细胞生长因子β链(β-chain)的质粒，将所述表达肝细胞生长因子α链的质粒和表达肝细胞生长因子β链的质粒共转染至哺乳动物细胞中，培养；

所述肝细胞生长因子α链的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述肝细胞生长因子β链的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在其中一些实施例中，所述表达肝细胞生长因子α链的质粒上还含有编码信号肽的片段，所述编码信号肽的片段与编码肝细胞生长因子α链的片段依次连接。

在其中一些实施例中，所述表达肝细胞生长因子α链的质粒的构建方法包括以下步骤：以pUC57-HGF为模板，通过核苷酸序列如SEQ ID NO.5和核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的引物扩增，得目的片段A；将目的片段A与表达载体连接，即得。

在其中一些实施例中，所述表达肝细胞生长因子β链的质粒上还含有编码信号肽的片段，所述编码信号肽的片段与编码肝细胞生长因子β链的片段依次连接。