[发明专利]一种用于拯救猪肠道甲型冠状病毒的系统、方法及应用

说明书

本发明公开了一种用于拯救猪肠道甲型冠状病毒的系统、方法及应用。所述系统包括：包含猪肠道甲型冠状病毒全基因组DNA的重组转录载体；包含SeACoV‑N基因的辅助质粒。本发明成功构建了SADS‑CoV/SeACoV反向遗传操作系统，产生的病毒可连续传代，拯救病毒与亲本病毒具有一致生物学特性。建立反向遗传学系统受到病毒基因组序列的不稳定性和毒性的阻碍，该拯救方法在猪冠状病毒反向遗传学研究和疫苗创制上具有潜在应用价值，在病毒基因功能研究等方面有广泛的应用前景。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种用于拯救猪肠道甲型冠状病毒的系统、方法及应用。

背景技术

中国是世界第一养猪大国，规模化养殖发展迅速。但随着规模化养猪的快速发展，冠状病毒感染对养猪业的危害越来越大。因此，加强猪冠状病毒的感染与致病机理的认识，将为这些疫病防控提供新的理论与技术支持。

2017年在华南首次发现的猪肠道甲型冠状病毒(swine entericalphacoronavirus，SeACoV)又称猪急性腹泻综合征病毒(Swine acute DiarrhoeaSyndrome Coronavirus，SADS-CoV)引发仔猪严重腹泻，是进化起源为蝙蝠HKU2-CoV的新型冠状病毒。与HKU2相比，SADS-CoV/SeACoV的S蛋白存在高度变异，并主要集中在N端区域(NTD，domain 0)的1-238位氨基酸：该区域有75个氨基酸点突变及2个氨基酸的插入。我们推测NTD上的高度变异可能导致了从蝙蝠冠状病毒HKU2变异为猪SeACoV，从而跨种属从蝙蝠传播到猪。但目前对该病毒的研究几乎一片空白。

猪腹泻相关病毒对全球养猪业产生巨大的威胁，因此需要更深入地了解这类病毒。目前面临的主要问题在于缺乏适用于研究猪冠状病毒SADS-CoV/SeACoV的遗传工具。

冠状病毒科的病毒是单股正链RNA病毒，其基因组具有重叠的ORF编码复制酶(ORF1a，1b)，非结构蛋白以及ORF3，纤突蛋白(S)，包膜蛋白(E)，膜蛋白(M)和核衣壳蛋白(N)。研究冠状病毒的发病机制目前很大程度上受到分离培养和缺乏可操纵病毒遗传工具的限制。相较于其他病毒，冠状病毒具有长度约27-30kb的基因组，是RNA病毒中最大的，其在用于产生感染性克隆的工程载体中存在显着的挑战，天然和扩增相关突变之间的区别和测序错误可能极其困难。此外，建立反向遗传学系统的尝试受到病毒基因组序列的不稳定性和毒性的阻碍。

反向遗传技术是开展病毒研究的一种有用平台，在阐明病毒致病机制和疫苗研制中能够发挥重要作用。同样，构建猪冠状病毒SADS-CoV/SeACoV感染性分子克隆，以此为基础可以对SADS-CoV/SeACoV的特定基因展开更为有效的研究，也是SADS-CoV/SeACoV研究的一个有用平台。

目前，国内外尚无SADS-CoV/SeACoV的反向遗传系统的被成功构建的报道。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的不足，提供了一种能够成功拯救出猪肠道甲型冠状病毒的病毒拯救系统。

一种用于拯救猪肠道甲型冠状病毒的系统，包括：

包含猪肠道甲型冠状病毒全基因组DNA的重组转录载体；

包含SeACoV-N基因的辅助质粒，

其中，所述猪肠道甲型冠状病毒为单股正链RNA病毒，所述猪肠道甲型冠状病毒全基因组DNA是指猪肠道甲型冠状病毒正链RNA序列对应的DNA序列，所述SeACoV-N基因的序列为猪肠道甲型冠状病毒编码该基因的RNA序列对应的DNA序列。

由于猪肠道甲型冠状病毒为单股正链RNA病毒，所以拯救时使用的为病毒的基因组RNA对应的DNA序列，即仅将RNA序列中的碱基U变为T。