[发明专利]一种重组大肠杆菌的构建及其应用

说明书

本发明属于酶催化领域，具体公开了一种生物催化制备(S)‑4‑氯‑3‑羟基丁酸乙酯的重组大肠杆菌的构建及其应用。本发明所提供的重组大肠杆菌能够同时表达酮还原酶和葡萄糖脱氢酶，并在细胞周质空间内表达，表达的酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的酶活性高，利用该构建的重组大肠杆菌全细胞催化制备(S)‑4‑氯‑3‑羟基丁酸乙酯，无需添加辅酶或辅酶因子，解决了传统微生物法催化制备(S)‑4‑氯‑3‑羟基丁酸乙酯成本高昂的问题，转化率高达99.9％，ee值高达100％。

技术领域

本发明属于酶催化领域，具体涉及一种重组大肠杆菌的构建及应用，更具体地涉及一种生物催化制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的重组大肠杆菌的构建及应用。

背景技术

瑞舒伐他汀钙最早是由日本野义公司开发，2007年4月阿斯利康制药公司瑞舒伐他汀获得国家食品药品监督管理局批准上市。瑞舒伐他汀钙是一种选择性HMG-CoA还原酶抑制剂，其主要的功能就是用于高血胆固醇症、单纯性高血脂甘油三酯症以及混合型血脂紊乱等三种病症的治疗，尤其是这种药物的使用对于降低胆固醇和油脂类指标存在较为突出的作用。光学纯的(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯(Ethyl 4-chloro-3-hydroxyrate，(S)-CHBE)是一种重要的有机中间体，其最主要的用途是作为合成降胆固醇药物阿托伐他汀的前体化合物。其手性单一对映体(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯((S)-CHBE)同样可用于其他很多活性药物的合成，如羟甲基戊二酰CoA(HMG-CoA)还原酶抑制剂和1,4-二氢吡啶类β-阻滞剂等。

潜手性物质4-氯乙酰乙酸乙酯(Ethyl 4-chloro-3-oxobutanoate，COBE)具有易于合成且价格低廉的优点，以其为反应底物进行不对称还原反应获取(S)-CHBE是非常经济有效的制备途径。

目前所知的从COBE还原为手性醇的方法主要有三条路径：

1、化学催化剂不对称还原法：用铑、钌等金属催化剂对COBE进行不对称还原。缺点是产物立体选择性不够高，催化还原反应需要很高的氢气压，耗能高；

2、酶催化不对称还原法，用提取纯化后的酶(商品酶)如乙醛还原酶等进行不对称还原，缺点是需要添加昂贵的辅酶；

3、微生物催化不对称还原法，即通过完整的微生物细胞(如面包酵母)的立体选择性生物催化来实现。

综合以上三种方法中，化学催化剂不对称还原法，采用的金属催化剂价格昂贵，另外产物立体选择性不够高，催化还原反应需要很高的氢气压，耗能高、废弃的重金属催化剂对环境污染大。酶催化不对称还原法存在过程操作繁琐和酶容易失活的缺陷，且需要添加价格昂贵的辅酶(一般为NADH或NADPH)，成本较高。微生物催化法有着反应条件温和，反应迅速，副产物产生少，产物的处理简单等优势，因此越来越受到关注。但要筛选获得高立体选择性的优良微生物菌株比较困难；同时也需要添加辅酶，并不断供给能量物质，另外还有底物对菌体的毒性及在水溶液中的不稳定性问题；由于微生物细胞内存在的酶系复杂，往往催化产物的光学纯度不高。

以重组的还原酶直接进行催化反应，需要按照化学剂量添加大量昂贵辅酶(NADH、NADPH)。因此，为了获得高产量、高纯度的(S)-CHBE，需要克隆脱氢酶基因实现辅酶的高效原位再生，以提供一种高效率的辅酶再生循环体系。

CN103173503A公开了一种用于不对称制备(S)-CHBE的重组大肠杆菌，是导入酮还原酶基因KRED)的大肠杆菌。用于为表达葡萄糖脱氢酶(GDH)的大肠杆菌提供催化反应所必须的还原力NAD(P)H。该方法是将酮还原酶及葡萄糖脱氢酶分别导入不同的大肠杆菌，再选择这两种提供不同酶的大肠杆菌加入到反应体系，反应过程中需要加入少量的NAD(P)H，并且大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-KRED活较低，反应时间长达12h，并且反应与COBE底物浓度、双菌质量比，葡萄糖浓度、产物浓度等多因素的影响，产物转化率较低，反应12h后最高才达到92％。