[发明专利]用于制备mPRα单克隆抗体的免疫原

说明书

本发明提供了一种用于制备mPRα单克隆抗体的免疫原，属于生物技术领域。该免疫原为多肽，氨基酸序列为YEARRPIYE PLHTHWPHN。本发明还提供了一种将该免疫原制备成的mPRα单克隆抗体的制备方法，通过对目的多肽YEARRPIYE PLHTHWPHN于与KLH交联，之后依次经免疫原制备和免疫小鼠、杂交瘤细胞制备、融合细胞筛选、杂交瘤细胞的克隆化、腹水法制备单克隆抗体、单克隆抗体鉴定及纯化等步骤获得。本发明还提供了一种上述mPRα单克隆抗体在制备精子生理调节机制药物或男性避孕药中的应用。该免疫原制成的mPRα单克隆抗体具有高效价、特异性，能特异性识别mPRα，可以为调控精子功能化合物和男性避孕药的新型分子靶点。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及用于制备mPRα单克隆抗体的免疫原。

背景技术

当今，生育问题已成为全世界范围内的健康和社会问题。另一方面，目前全球人口总量已达70亿总人口，寻找理想的避孕方式以主动控制人口数量具有重大的意义。当前市场中避孕药主要是针对女性的激素类药物，尚无市场化针对男性生殖生理的避孕药物。基于现有女用避孕药的副作用以及人们生殖伦理观的改变，研发安全、有效、易恢复的男性避孕药具有非常广阔的市场需求。因此，在分子水平揭示男性生殖调控的机制，对于研究男性不育症的病理生理机制、探索其可能的治疗途径以及开发新型男性避孕药物，均具有重要的社会意义。

生理激素孕酮是调节精子功能的重要生理激素且精子响应孕酮能力下降是男性不育症的常见病征。精子胞膜上的孕酮受体是精子响应孕酮的关键蛋白，可作为开发调控精子功能化合物和男性避孕药的新型分子靶点。然而，目前精子中功能性孕酮膜受体鲜有报道，也未开发相关靶向药物。

单克隆抗体具有特异性、多样性和定向性特点，具有成为靶向药物的潜力。找寻合适的免疫原是制备单克隆抗体的关键，进一步研究制备精子生理调节机制工具药和制备男性避孕药具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于制备孕酮膜受体mPRα单克隆抗体的免疫原，该免疫原制备的单克隆抗体具有效价高、特异性好的特点。该单克隆抗体与人精子孵育可显著抑制人精子对孕酮的响应(钙含量、CatSper电流、穿粘液能力以及顶体反应的增加)。

用于制备mPRα(孕酮膜受α，membrane progesterone receptorα，UniProtKB：Q86WK9)单克隆抗体的免疫原为多肽，氨基酸序列为YEARRPIYE PLHTHWPHN。

本发明还涉及前述免疫原制备的mPRα单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：

1)多肽合成：合成目的多肽YEARRPIYE PLHTHWPHN，并与钥孔血蓝蛋白(KLH)交联；

2)免疫原制备和免疫小鼠：取5只6-8周Balb/c小鼠雌性小鼠，用400μl 0.01mol/l磷酸缓冲液溶解50μg(1只剂量)上述KLH交联多肽，与弗氏完全佐剂等比例混合，充分震荡乳化，将该乳化的免疫原在小鼠多点皮下注射，间隔3周后，第二次免疫，剂量途径同第一次免疫，佐剂换成弗氏不完全佐剂，间隔3周后，第三次免疫，剂量同上(但用200μl磷酸缓冲液)，不加佐剂，腹腔注射，7天后尾部采血ELISA检测抗体效价，间隔3周后，再加强一次免疫，腹腔注射，3天后，取脾融合；

3)制备杂交瘤细胞：制备饲养细胞(小鼠腹腔巨噬细胞)和骨髓瘤细胞备用；提取免疫小鼠脾细胞，并将该脾细胞与骨髓瘤细胞融合；

4)融合细胞的筛选：在HAT选择培养液中筛选杂交瘤细胞；

5)杂交瘤细胞的克隆化和冻存：有限稀释法将抗体阳性的杂交瘤细胞筛选出分泌抗体的杂交瘤细胞克隆，对培养上清进行ELISA检测，挑选阳性亚克隆并进行标准处理；

6)腹水法制备单克隆抗体：腹腔注射阳性杂交瘤细胞，接种7-10天后抽取腹水。