[发明专利]诱导肿瘤细胞上调抗原MUC1表达用CAR及其应用

说明书

本申请属于肿瘤细胞免疫治疗技术领域，具体涉及一种能诱导肿瘤细胞上调抗原MUC1表达的CAR及其应用专利申请事宜。该嵌合抗原受体为一若干蛋白片段连接的氨基酸序列，具体为：依次连接的人CD8a分子信号肽、人源化MUC1单链抗体、人CD8分子跨膜区与41BB分子胞内区、人CD3z分子胞内区；优选设计中，人CD3z分子胞内区进一步通过连接序列与IL22 CDS区序列进行连接，以进一步通过IL‑22这一细胞因子来促进MUC1的表达。本申请通过对于CAR的进一步结构优化，对于有效诱导肿瘤细胞表面抗原MUC1表达、减少脱靶效应的发生，以及提高CAR‑T细胞的应用效果都表现出良好的技术效果。

技术领域

本申请属于肿瘤细胞免疫治疗技术领域，具体涉及一种能诱导肿瘤细胞上调抗原MUC1表达的CAR（Chimeric Antigen Receptor，嵌合抗原受体）及其应用专利申请事宜。

背景技术

CAR-T（Chimeric Antigen Receptor T-Cell，嵌合抗原受体T细胞）作为肿瘤免疫治疗的一种有效治疗方式，已在2017年8月30日被美国食品和药物管理局(FDA)批准上市用于治疗急性淋巴细胞白血病(ALL)，其以CD19为靶点可以有效的清除CD19⁺肿瘤细胞，在临床前和临床实验中表现出了令人鼓舞的结果，并且已经证明他们在具有难治性和复发性的b-前体急性淋巴细胞性白血病儿童和青少年中进行的有效抗白血病效应是安全可行的，所有的毒性可逆并且没有发生持续的B细胞发育不全。但是其在实体瘤中的应用目前尚不尽人意，还有许多问题需要解决，主要原因是在于实体瘤中没有类似于CD19的有效的肿瘤特异性抗原以及肿瘤微环境的抑制作用。

慢病毒属于逆转录病毒科的一种RNA病毒，其中最为人所知的是人类免疫缺陷病毒(HIV-1)。HIV-1直径约120nm，含两条正链 RNA，可有效的进入细胞核中，对分裂期细胞及非分裂期细胞均具有很高的感染效率。慢病毒感染细胞后可将所携带的基因整合到细胞基因组中，并且长时间持续稳定表达，同时能够随细胞分裂稳定遗传下去，因此成为导入外源基因的有效工具。慢病毒载体是一种以 HIV-1为基础改造而成的基因治疗载体，通过去除致病基因，同时减少辅助质粒与载体质粒的同源性，使改造后的慢病毒具有了滴度更高、生物安全性更好、导入外源片段的能力更强等特性。目前慢病毒系统已经广泛应用到基因过表达、RNA 干扰、miRNA 研究及基因敲除等功能研究的细胞和动物实验中。

MUC1（Mucin1，黏蛋白1）是一种大分子跨膜糖蛋白，广泛且高表达于乳腺癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌、结肠癌、肝癌和胰腺癌等恶性肿瘤细胞中，且相对于正常细胞，肿瘤细胞表面的MUC1具有不同的糖基化结构。理论而言，基于MUC1的表达特点，可以较好用于肿瘤细胞和非肿瘤细胞的区分，而过表达和糖基化异常也使得MUC1可成为各种免疫治疗尤其是CAR-T治疗的理想靶点，但实际应用中，受限于MUC1表达量等原因，目前尚未见到较好的应用效果。

发明内容

本申请目的在于提供一种能诱导肿瘤细胞上调抗原MUC1表达的CAR，从而为相关CAR-T在实体瘤的治疗中奠定一定技术基础。

本申请所采取的技术方案详述如下。

一种能诱导肿瘤细胞上调抗原MUC1表达的CAR，该嵌合抗原受体为一若干蛋白片段连接的氨基酸序列，以MUC1-41BB-CD3z命名，具体为：依次连接的人CD8a分子信号肽（CMV）、人源化MUC1单链抗体（scFV.MUC1）、人CD8分子跨膜区与41BB分子胞内区（41BB）、人CD3z分子胞内区（CD3Zeta），即：CMV—scFV.MUC1—41BB—CD3Zeta（CD3ζ）；

优选设计中，人CD3z分子胞内区（CD3Zeta）进一步通过连接序列（具体例如采用TA2连接序列（T2A））与IL22 CDS区序列（IL22）进行连接，以进一步通过IL-22这一细胞因子来促进MUC1的表达，即总体结构为：CMV—scFV.MUC1—41BB—CD3Zeta（CD3ζ）—T2A—IL22，该优选设计以MUC1-41BB-CD3z-IL22命名；