[发明专利]一种基于铁蛋白三维结构免疫传感器的制备方法及应用

说明书

本发明涉及一种基于铁蛋白三维结构免疫传感器的制备方法及应用，属于新型纳米材料领域与生物传感技术领域；本发明利用电致化学发光ECL技术，以铁蛋白作为基底，在其外部共价交联ECL发光分子N‑(4‑氨丁基)‑N‑乙基异鲁米诺分子得到异鲁米诺‑铁蛋白，通过调控反应条件，在异鲁米诺‑铁蛋白表面原位还原纳米金，得到一种新颖的三维杂化纳米结构异鲁米诺‑铁蛋白‑纳米金，并基于该结构提出了一种免疫传感器的制备方法，该方法具有制备简单、成本低、反应能耗低、绿色环保的优点，将传感器用于降钙素原的检测，具有灵敏度高、特异性强、重现性好的优点，其检出限为3.4 fg/mL，线性范围10 fg/mL‑50 ng/mL，在降钙素原的临床检测中有着明显的潜在应用价值。

技术领域

本发明属于新型纳米材料领域与生物传感技术领域。

背景技术

铁蛋白是动植物、微生物体内广泛存在的一类贮存铁的可溶性蛋白，是在进化上高度保守的生物分子，在哺乳类动物的肝和脾中含量较多，铁蛋白分子结构包括两部分：蛋白外壳和铁核，铁蛋白的蛋白质外壳表面暴露了很多氨基、羟基等官能团，而铁核部分则被证明可以催化过氧化氢分解成超氧自由基，因此铁蛋白不仅易于进行表面化学修饰且具有较好的类过氧化物酶作用；N-(4-氨丁基)-N-乙基异鲁米诺，简称异鲁米诺，具有优秀的电致化学发光性能，作为鲁米诺的衍生物，由于其分子结构中含有氨基且远离苯环，使该氨基要比鲁米诺的更活泼，异鲁米诺不仅易于化学修饰，还体现出了比鲁米诺更强的还原性，可以在一定条件下还原氯金酸根离子制备纳米金，而其电致化学发光性能几乎不受影响。

降钙素原作为诊断脓毒症和鉴别严重细菌感染的生物标志物，它的灵敏检测可显着提高脓毒症诊断的敏感性和特异性。目前，用于检测降钙素原的主要是电化学生物传感器，但这种方法存在重新性差、灵敏度低的缺点。由于电致化学发光技术结合了化学发光与电化学两种技术的优势，除了具有易于操作、可控性强、响应速度快等特点，其灵敏度也要比电化学更高，检测限也更低，可见，基于电致化学发光技术制备的生物传感器具备了比电化学技术更强的优势，这为免疫新方法的提出提供了一种更为强有力的技术支持，本发明正是基于电致化学发光技术而提出的一种生物传感器的制备方法，旨在为弥补现有检测方法的不足，为降钙素原的早期临床检测提供一种全新的分析方法。

发明内容

本发明的技术任务之一是为了弥补现有检测技术的不足，提供一种基于铁蛋白三维结构免疫传感器的制备方法及应用，该方法制备过程简单、绿色环保、成本低、信号响应迅速，大大缩短了检测的时间，省时省力。

本发明的技术任务之二是提供所述免疫传感器的用途，该传感器能够快速检测降钙素原，具有灵敏度高、特异性强、重现性好的优点，检出限为3.4 fg/mL，线性范围10 fg/mL-50 ng/mL。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

1. 一种基于铁蛋白三维结构免疫传感器的制备方法及应用，包括以下步骤：

（1）将直径为4 mm的玻碳电极依次用1.0 μm、0.3 μm、0.05 μm氧化铝抛光粉抛光处理，用超纯水冲洗干净；

（2）在玻碳电极表面滴涂6 μL、浓度为2 ~ 4 mg/mL的抗体标记的异鲁米诺-铁蛋白-纳米金溶液作为传感器基底材料，将其置于37 °C晾干；

（3）滴加3 μL、质量分数为1 ~ 3%的牛血清白蛋白溶液，以封闭电极表面的非特异性活性位点，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液PBS冲洗电极表面，将其置于4 °C晾干；

（4）滴加6 μL 降钙素原的标准溶液或未知浓度的降钙素原溶液，37 °C下孵化0.5 ~ 2h，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液PBS冲洗电极表面，将其置于4 °C晾干，传感器构建完毕。

2. 一种基于铁蛋白三维结构免疫传感器的制备方法及应用，所述抗体标记的异鲁米诺-铁蛋白-纳米金溶液，通过以下步骤制备：