[发明专利]一种靶向KRAS突变的异体抗原递呈细胞、构建方法及肠癌特异性CTL细胞的制备方法

说明书

本发明提供了一种靶向KRAS突变的异体抗原递呈细胞、构建方法和肠癌特异性CTL细胞的制备方法，属于肿瘤靶向治疗技术领域，所述靶向KRAS突变的异体抗原递呈细胞的构建方法包括以下步骤：1)分析某一肠癌患者的HLA分型和KRAS突变序列组合的亲和力，选择亲和力最高的组合合成融合基因；2)将合成的融合基因连接到表达载体上获得重组载体；3)将所述重组载体转入健康来源的单核细胞，进行诱导培养获得靶向KRAS突变的异体抗原递呈细胞。所述靶向KRAS突变的异体抗原递呈细胞，解决了异体DC与患者HLA分型不匹配的问题，可以刺激更强的免疫反应。所述肠癌特异性CTL细胞对靶细胞具有良好的杀伤效果。

技术领域

本发明属于肿瘤靶向治疗技术领域，尤其涉及一种靶向KRAS突变的异体抗原递呈细胞、构建方法和肠癌特异性CTL细胞的制备方法。

背景技术

肠癌患者中，KRAS突变，是对靶向药抗药的原因之一；因此，KRAS突变患者很难从靶向药中获益，生存期短，因此，迫切需要开发针对KRAS突变的免疫细胞治疗手段。同时，患者来源的树突状细胞DC，数量少，能力差，如果以自体的DC作为KARS的抗原提呈，制备的细胞毒性T淋巴细胞CTL中，特异性细胞比例少，杀伤能力弱。如果是异体DC，HLA又不匹配，无法使用。

因此，如何制备高效提呈KRAS突变抗原的DC，并以此DC制备靶向各种KRAS突变的CTL，以杀伤各种KRAS突变的实体肿瘤是目前急需解决的技术难题。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种靶向KRAS突变的异体抗原递呈细胞的构建方法。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

一种靶向KRAS突变的异体抗原递呈细胞的构建方法，包括以下步骤：

1)分析某一肠癌患者的HLA分型和KRAS突变序列组合的亲和力，选择亲和力最高的组合合成融合基因；

2)将步骤1)中合成的融合基因连接到表达载体上获得重组载体；

3)将步骤2)所述重组载体转入健康来源的单核细胞，进行诱导培养获得靶向KRAS突变的异体抗原递呈细胞。

优选的，所述分析亲和力的工具为NetMHCpan 4.0Server在线软件。

优选的，所述融合基因还包括连接HLA分型和KRAS突变序列的剪切肽的编码序列。

优选的，所述肠癌患者的HLA分型包括HLA-A0206、HLA-A2601、HLA-B4001、HLA-B1301、HLA-C0304和HLA-C0702。

优选的，所述KRAS突变包括KRAS-G12A、KRAS-G12C、KRAS-G12D、KRAS-G12S、KRAS-G12V、KRAS-G13D和KRAS-Q61H。

优选的，亲和力最高的组合为HLA-A0206和KRAS-G12D。

优选的，所述剪切肽包括P2A、T2A和E2A中的一种。

优选的，所述融合基因表达的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示。

本发明还提供了所述制备方法制备获得的靶向KRAS突变的异体抗原递呈细胞。

本发明还提供了一种肠癌特异性CTL细胞的制备方法，包括以下步骤：用所述的靶向KRAS突变的异体抗原递呈细胞与外周血单个核细胞中的T细胞进行共培养20～22d获得肠癌特异性CTL细胞

优选的，所述的外周血单个核细胞来源于步骤1)中所述的肠癌患者或者步骤3)中所述的单核细胞的提供者。