[发明专利]以序列优化的分泌形式的FAPα为基础的肿瘤DNA疫苗的应用

说明书

本发明涉及以序列优化的分泌形式的FAPα为基础的肿瘤DNA疫苗的应用，属于肿瘤DNA疫苗领域。涉及一种FAPα来源的分泌形式FAPα胞外段序列shF(m)及其密码子优化序列OshF(m)以及以两种序列为基础构建的DNA疫苗在制备肿瘤治疗性疫苗中的应用。本发明通过免疫原性实验和抗肿瘤实验确定了上述DNA疫苗相比具有原始FAPα序列的DNA疫苗具有更强的抗肿瘤活性，同时序列OshF(m)与原始序列的同源性只有76％，且能更好的表达目的蛋白，在制备以FAPα为基础的各类肿瘤疫苗中具有更好的应用前景。

技术领域

本发明涉及肿瘤DNA疫苗领域，具体地说，本发明涉及靶向FAPα的重组DNA载体CpVR-shF(m)及其密码子优化后的重组DNA载体CpVR-OshF(m)在制备抗肿瘤疫苗中的应用。

背景技术

肿瘤微环境(TME)是肿瘤赖以生存的场所，为肿瘤生长提供必要的养分，同时将肿瘤细胞与免疫细胞隔离开来，组织免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤。癌症相关成纤维细胞(CAFs)是肿瘤微环境中重要的组成部分，与肿瘤的生长，侵袭，转移密切相关，可以通过与肿瘤细胞直接相互作用，分泌可溶性细胞因子(例如基质细胞衍生因子：SDF-1)，重塑细胞外基质等手段促进肿瘤的生长。成纤维细胞激活蛋白α(FAPα)是肿瘤微环境中CAFs表面的特异性标志物，具有胶原酶和二肽基肽酶活性，可以重塑肿瘤细胞外基质，促进肿瘤生长转移。研究表明通过敲除小鼠肿瘤内的FAPα阳性的CAFs能够明显抑制肿瘤的生长，并且促进了肿瘤内T细胞的浸润，增强了疫苗的抗肿瘤效果。而且在超过90％的人类上皮细胞癌组织中(如乳腺癌，结直肠癌，胰腺癌，肺癌等)，FAPα的表达量均明显提高，因此CAFs以及FAPα作为肿瘤治疗的靶点被广泛地研究。目前国内外针对它们的治疗策略包括：1)靶向FAPα的抗体治疗；2)反义RNA沉默FAPα表达；3)FAPα酶活性的抑制剂；4)靶向FAPα的肿瘤疫苗(DNA疫苗、树突状细胞疫苗、瘤苗等)；5)嵌合抗原受体T细胞疗法。

在我们的前期工作中，构建了一种靶向FAPα的DNA疫苗(CpVR-FAP)，其包含了全长的人源FAPα，而且为了提高疫苗的安全性，把FAPα由氨基酸序列第624位的丝氨酸(Ser624)进行了突变，以去除掉FAPα的酶活性。并且证明了这种疫苗具有一定的抗肿瘤活性。但当把疫苗的治疗时间点延后至肿瘤形成之后，CpVR-FAP的抗肿瘤活性几乎消失。这说明全长的FAPα在应用到肿瘤治疗上仍然具有一定安全性问题，而且疫苗的有效性也需要提高。近期研究表明，全长的FAPα可以通过非酶活性来促进肿瘤的生长，而且特定的跨膜区域对FAPα的二聚化及活性有重要的影响，这为我们疫苗的设计和优化提供了思路。

发明内容

本发明的目在于提供两种优化的具有抗肿瘤活性的FAPα来源的DNA片段，可应用制备抗肿瘤疫苗，并且本发明还构建了它们的DNA疫苗形式。同时该发明还提供了两种靶向FAPα的DNA疫苗在抗肿瘤治疗中的应用。

下面对本发明的技术方案介绍如下：

本发明所述的一种SEQ ID NO:1所示的shF(m)DNA片段，所述序列包含一段Kozak序列，一段分泌信号肽tPA序列，及FAPα胞外段核苷酸序列(氨基酸序列为27位到760位)。

本发明所述的一种SEQ ID NO:2所示的shF(m)DNA片段，具有与shF(m)相同的氨基酸序列，在序列SEQ ID NO:1基础上进行了密码子优化，提高了蛋白表达水平；SEQ ID NO:2与SEQ ID NO:1的核苷酸序列同源性下降到76％，更有助于在体内对基因分布进行监测。

本发明还包括上述DNA片段序列制备的DNA疫苗及其在抗肿瘤免疫治疗中的应用。