[发明专利]酿酒酵母细胞催化生产γ-氨基丁酸方法及γ-氨基丁酸

说明书

本发明涉及生物技术领域，其目的在于提供一种用酿酒酵母细胞催化生产γ‑氨基丁酸的方法，(1)从谷氨酸脱羧酶中提取目标基因；对所述目标基因进行PCR扩增，并连接到质粒重组构建克隆载体；(2)通过限制性内切酶对克隆载体进行酶切处理得到目标基因片段，连接到酵母载体中，产生重组质粒；(3)通过醋酸锂快速转化法将重组质粒导入酿酒酵母中，获得重组酿酒酵母细胞；(4)将重组酿酒酵母细胞培养在Na₂HPO₄柠檬酸缓冲液中，L‑谷氨酸和5'‑磷酸吡哆醛混合，反应得到γ‑氨基丁酸。本发明还提供一种γ‑氨基丁酸。酿酒酵母细胞生产速度快培养简单，外源基因表达系统完善，催化效率高，并且成本低，易控制。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用酿酒酵母细胞催化生产γ-氨基丁酸的方法及γ-氨基丁酸。

背景技术

γ-氨基丁酸(GABA)是一种非蛋白原性氨基酸，白色粉末，广泛存在于自然界中，易溶于水，微溶于热乙醇，不溶于冷乙醇、乙醚和苯。GABA可降低血氨，促进大脑新陈代谢，调节体内代谢平衡；可作为神经递质信号的抑制剂，可调节睡眠，治疗人体头痛、肝昏迷、高血压等生理疾病，同时还能合成2-吡咯烷酮和4-聚酰胺尼龙，应用在食品和工业生产。谷氨酸脱羧酶(GAD)是一种5′-磷酸吡哆醛(PLP)依懒性的脱羧酶，存在于细菌、酵母和丝状真菌中。

目前，生物法合成GABA主要包括酶转化法和微生物发酵法。微生物发酵法合成GABA通常采用谷氨酸为底物来合成GABA基因，其中包括了大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、乳酸菌等。谷氨酸生产条件一般控制在偏中性环境，而GAD催化的pH范围在4～6之间，这就会因前后两个途径所需环境不同而导致GABA合成效率较低。虽然采用双阶段发酵葡萄糖也可以合成GABA，但是用微生物发酵法合成的GABA产量还无法和酶催化法相比较。另外，发酵法由于其发酵液中成分复杂，对下游分离提取造成不小的负担。

酶催化法合成GABA通常以谷氨酸为底物，通过GAD进一步催化合成GABA，相对于微生物发酵法，酶催化法的步骤单一，反应体系成分简单。到目前为止，GAD基因已在原核生物中被鉴定出来，如链霉菌、大肠杆菌、神经孢菌等。GABA的酶法合成由于反应过程简单，催化效率高，反应条件温和，环境相容性好，成本低，因此前景广阔。

GAD作用pH偏酸性，需要加入无机盐维持最适催化环境，虽然会增加一些生产附加成分，但是GAD在偏中性环境中的催化活力和催化效率大大提高。并且相对于传统的利用乳酸菌或者短乳杆菌进行催化反应，酿酒酵母的产量较高，再者具有真核生物的特征，生长迅速，培养简单，外源基因表达系统完善，生产稳定，安全性较高，适合工业化生产食品级GABA的菌种。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目在于提供一种用酿酒酵母细胞催化生产γ-氨基丁酸的方法及γ-氨基丁酸，酿酒酵母细胞具有真核生物的特征，生产速度快培养简单，外源基因表达系统完善，并且催化效率高、成本低、易控制。

本发明的目的采用如下技术方案实现：

一种用酿酒酵母细胞催化生产γ-氨基丁酸的方法，包括以下步骤：

(1)提取基因：从谷氨酸脱羧酶中提取目标基因；

(2)构建质粒：对所述目标基因进行PCR扩增，并连接到质粒重组构建克隆载体；通过限制性内切酶对所述克隆载体进行酶切处理得到所述目标基因片段，并连接到酵母载体中，产生重组质粒；

(3)构建重组酿酒酵母细胞：通过醋酸锂快速转化法将所述重组质粒导入酿酒酵母中，获得重组酿酒酵母细胞；