[发明专利]酿酒酵母细胞催化生产γ-氨基丁酸方法及γ-氨基丁酸

权利要求书

1.一种用酿酒酵母细胞催化生产γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取基因：从谷氨酸脱羧酶中提取目标基因；

(2)构建质粒：对所述目标基因进行PCR扩增，并连接到质粒重组构建克隆载体；通过限制性内切酶对所述克隆载体进行酶切处理得到所述目标基因片段，并连接到酵母载体中，产生重组质粒；

(3)构建重组酿酒酵母细胞：通过醋酸锂快速转化法将所述重组质粒导入酿酒酵母中，获得重组酿酒酵母细胞；

(4)催化反应：将所述重组酿酒酵母细胞培养在0.05～0.5M在Na₂HPO₄柠檬酸缓冲液中，pH为3.8～7.0，当细胞密度为OD₆₀₀2～OD₆₀₀45时，与0.05M～1M L-谷氨酸和0.01～1mM5′-磷酸吡哆醛混合，在5℃～70℃条件下反应1～14h得到γ-氨基丁酸。

2.如权利要求1所述的用酿酒酵母细胞催化生产γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述目标基因为链霉菌属MJ654-NF4的SsGAD基因，或色褐链霉菌ATCC 49982的ScGAD基因。

3.如权利要求1所述的用酿酒酵母生产γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述重组酿酒酵母细胞培养在0.2M在Na₂HPO₄柠檬酸缓冲液中，pH为5.4，当细胞密度为OD₆₀₀30时，与0.1M～0.2M L-谷氨酸和0.04mM～0.28mM 5′-磷酸吡哆醛混合，在48℃～50℃条件下反应12h得到γ-氨基丁酸。

4.如权利要求2所述的用酿酒酵母细胞催化生产γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述步骤(2)中对SsGAD基因进行PCR扩增的引物序列为：

上游引物：5′-AACATATGGCCTTGTACAAGGGCACCT-3′，下游引物：5′-AAGTTTAAACTTAGTGGTGGAAGCCGGCGCGGACC-3′；

对ScGAD基因进行PCR扩增的引物序列为：

上游引物：5′-AACATATGCCACTCCACCAAGGCGCGGACA-3′，下游引物：5′-AAGTTTAAACTTAGTGGTGGAAGGCGGTGGCGGCCGGC-3′。

5.如权利要求1～4中任一项所述的用酿酒酵母细胞催化生产γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述步骤(2)还包括对扩增后的PCR产物进行凝胶纯化，再将产物连接到质粒pJET1.2/blu重组构建克隆载体。

6.如权利要求5中任一项所述的用酿酒酵母细胞催化生产γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述步骤(3)还包括将将重组质粒导入酿酒酵母细胞后，在SC-Trp液体培养基进行培养并收集所述重组酿酒酵母细胞进行超声破碎、研磨后取上清液，用考马斯亮蓝染色后进行电泳，获得重组酿酒酵母细胞。

7.如权利要求6所述的用酿酒酵母细胞催化生产γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述重组酿酒酵母细胞在SC-Trp液体培养基中以150～750转/分的速度振荡，直到OD₆₀₀值达到1.0～1.5。

8.如权利要求7所述的用酿酒酵母细胞催化生产γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述重组酿酒酵母细胞的培养时间为24h～96h。

9.如权利要求8所述的用酿酒酵母细胞催化生产γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述重组酿酒酵母细胞的培养时间为48h。

10.一种权利要求1-9中任一项所述的用酿酒酵母细胞催化生产γ-氨基丁酸的方法生产的γ-氨基丁酸。