[发明专利]一种CDK9/CyclinT1酶活性的快速检测方法及其应用

说明书

本发明涉及一种CDK9/CyclinT1酶活性的快速检测方法及其应用。该检测方法利用CDK9/CyclinT1酶在分子水平可以将底物磷酸化的原理，结合ADP‑Glo这种灵敏度非常高的技术，直接测定反应中消耗的ATP的量来定量反应的进程。整个反应可以在普通实验室条件下操作，不需要同位素实验室条件，降低了对操作人员和环境可能造成的辐射危险，安全性高。同时，该方法操作简单易行，整个反应可以在一天操作完成全部实验，大大缩短了检测时间，也能提高单次检测的数据量，更适合用于大量的化合物活性评价实验。因此，该方法可应用于CDK9/CyclinT1酶受体抑制剂的筛选和用于此靶点相关的抗肿瘤药物的筛选。

技术领域

本发明属于生物化学技术领域，具体涉及一种CDK9/CyclinT1酶活性的快速检测方法及其应用。

背景技术

周期蛋白依赖激酶(CDK9/CyclinT1)复合物的成员也称为正转录延伸因子B(P-TEFb)，它通过磷酸化RNA聚合酶II的大亚基C端结构域POLR2A、SUPT5H和RDBP来促进从终止延伸到积极伸长的过渡。这个复合物在7SK SNNP复合物存在的时候是没有活性的。磷酸化了EP300、MYOD1、RPB1/POLR2a和AR，以及负伸长因子DSIF和NELF之后，通过促进启动子识别目标转录因子(例如TNF-诱导松弛/p65激活和IL-6诱导STAT3信号)，调节细胞因子诱导转录网络，促进基因程序中的RNA合成，促进细胞生长和分化。

P-TEFb还参与了共转录组蛋白修饰、mRNA加工和mRNA外排。调节一个复杂的染色质修饰网络，包括H2Bub1、H3K4me3和h3k36me 3；将转录过程中的磷酸化与染色质修饰结合，以控制共转录组蛋白mRNA加工。

此靶点以往的研究文献中通常采用构建同位素的评价方法。这种方法采用³²P做标记。³²P半衰期有14.3天，衰变放出β射线。同位素实验需要在专用的同位素实验室内进行，并设有相应的防护屏蔽，设置计量检测仪器及必要的应急工具。从事放射工作的人员必须具备相应的专业及防护知识和健康条件，并提供相应的证明材料及工作人员健康档案。工作人员配备专用的工作服、鞋、帽、口罩、套袖、手套、防毒面具等个人防护用品。采用同位素方法进行CDK9/CyclinT1的化合物活性评价对实验室硬件和资质有要求，限制了实验的开展。且同位素试剂价格贵，试剂废液处理成本高，不适合作为大规模筛选实验评价化合物库的活性。

发明内容

针对现有技术中的技术空白，本发明的目的是提供一种CDK9/CyclinT1酶活性的快速检测方法及其应用，该方法利用CDK9/CyclinT1酶在分子水平可以将底物磷酸化的原理，结合ADP-Glo这种灵敏度非常高的技术，直接测定反应中消耗的ATP的量来定量反应的进程。整个反应可以在普通实验室条件下操作，且大大缩短了检测时间。该方法可应用于CDK9/CyclinT1酶受体抑制剂的筛选和用于此靶点相关的抗肿瘤药物的筛选。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明的第一个目的是提供一种CDK9/CyclinT1酶活性的快速检测方法，包括以下步骤：

(1)取待测样品、空白对照品、阳性对照品分别与CDK9/CyclinT1酶试剂、PDKTide/ATP混合液共孵育进行激酶反应产生ADP；

(2)向步骤(1)的三组激酶反应体系中分别添加ADP-GloTM反应试剂共孵育，终止激酶反应并消耗完剩余ATP；

(3)向步骤(2)的三组反应体系中分别添加激酶检测试剂共孵育，使ADP转化成ATP，并读取新合成的ATP的发光值RLU；