[发明专利]牛白细胞介素-2重组乳酸菌及其应用

权利要求书

1.牛白细胞介素-2重组乳酸菌，其特征在于，它是转化了质粒pNZ8148-BoIL-2到乳酸乳球菌NZ9000的乳酸菌，其中BoIL-2为牛白细胞介素-2基因的简称。

2.根据权利要求1所述的牛白细胞介素-2重组乳酸菌，其特征在于，所述BoIL-2的碱基序列如序列表SEQ ID No.1所示。

3.根据权利要求2所述的牛白细胞介素-2重组乳酸菌，其特征在于，密码子优化后BoIL-2的碱基序列如序列表SEQ ID No.2所示。

4.根据权利要求1所述的牛白细胞介素-2重组乳酸菌，其特征在于，所述质粒pNZ8148-BoIL-2是载体pNZ8148中插入了如序列SEQ ID No.2所述的基因。

5.基于权利要求1-4任一所述牛白细胞介素-2重组乳酸菌的制备方法，其特征在于，它包括：

1)、目的基因的合成

BoIL-2基因全长共468bp，利用HindⅢ和EcoR Ⅰ合成480bp BoIL-2基因；

2)、表达质粒pNZ8148-BoIL-2的构建

2.1目的基因BoIL-2与表达载体的酶切与纯化回收

将质粒pUC57-BoIL-2与载体pNZ8148分别用HindIII与KpnI进行双酶切，酶切时间为6h，完成后取3μL与少量l0×Loading Buffer混匀，跑0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定，将鉴定正确的酶切产物纯化回收；

2.2目的基因与表达载体的连接

将2.1得到的载体pNZ8148使用T4 DNA ligase16℃与目的基因BoIL-2连接过夜；

2.3连接产物转化到大肠杆菌MC1061F-感受态细胞中；

2.4大肠杆菌MC1061中重组质粒鉴定：

在平板中挑取单个菌落，37℃摇床过夜活化后提取质粒，进行PCR鉴定和双酶切鉴定；

PCR反应体系如下：

试剂：Premix Taq DNA聚合酶为50μL；引物P_上为2μL；引物P_下为2μL；模板为2μL；ddH2O为44μL；体系为100μL；

反应条件为：94℃30sec；60℃30sec；循环30次，72℃延展1min，反应完成后取3μL产物进行1％凝胶电泳鉴定，观察结果；

使用内切酶KpnI和HindIII对疑为阳性的重组质粒进行双酶切鉴定；于37℃恒温水浴锅中酶切3h，取3μL进行1％凝胶电泳；

双酶切反应体系如下：

试剂：重组质粒为8μL；HindIII为2μL；KpnI为2μL；10×M缓冲液为2μL；ddH2O为6μL；体系为20μL；

2.5重组表达质粒的的序列测定

鉴定正确的质粒进行测序，对于测序比对结果正确的阳性质粒命名成pNZ8148-BoIL-2；

3)重组乳酸菌L.lactis NZ9000/pNZ8148-BoIL-2的构建

3.1重组质粒pNZ8148-BoIL-2的提取

3.2质粒pNZ8148-BoIL-2电转化至L.lactis NZ9000。

6.根据权利要求5所述的的牛白细胞介素-2重组乳酸菌的制备方法，其特征在于，所述2.3连接产物转化到大肠杆菌MC1061F-感受态细胞中具体为：

2.3.1将MC1061F-感受态细胞从-80℃冰箱中拿出，放入到冰水混合物中缓慢融化，待MC1061F-感受态细胞融化后将连接产物10μL加入到其中，用手轻轻拨动EP管底，待混匀后在冰水混合物中静置25min；

2.3.2将EP管迅速插入42℃水浴中，热激45秒，迅速取出放回冰水混合物中静置5min，动作尽量小心，不要晃动；

2.3.3向EP管中加入700μL无抗性无菌LB培养基，轻轻混匀，37℃，500rpm水平摇床中复苏30min；

2.3.4低温离心机中5000rpm，1min离心，收集菌体沉淀，留取100μL左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含有氯霉素的LB培养基上；

2.3.5将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。