[发明专利]一种天然纳米囊泡及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种天然纳米囊泡在制备调控细胞转移及TGF-β信号通路抑制剂中的应用。

2.一种天然纳米囊泡在制备各种急慢性肝病或急慢性肝病引起的肝脏损伤药物或抑制剂中的应用。

3.一种天然纳米囊泡在制备HCC原发性肝癌的药物或抑制剂中的应用。

4.根据权利要求1或3所述的应用，其特征在于：所述的细胞为HCC原发性肝癌细胞来源的外泌体。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述的HCC原发性肝癌细胞来源的外泌体促进体内HCC侵袭、转移。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述的HCC原发性肝癌细胞来源的外泌体体可通过转运成纤维细胞生长因子FGF、血管内皮生长因子VEGF和表皮生长因子EGF活化受体细胞，影响细胞生长、迁移。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述的HCC原发性肝癌细胞来源的外泌体通过自/旁分泌方式转运其内的部分生物活性因子改变肿瘤微环境的分子构成，调控肿瘤EMT发生。

8.权利要求1所述的天然纳米囊泡的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)外泌体的提取：患者血清中外泌体的提取采用Exoquick TM Kit(SystemBiosciences，USA)方法；

(2)透射电子显微镜TEM观察提取的外泌体：血清提取的外泌体沉淀经PBS溶液混悬，取5-20μl获取的外泌体溶液经1％戊二醛固定5-20分钟，经纯化水冲洗，然后将2-10μl的悬液滴加在已覆膜的铜网，室温静置10-30分钟使其干透，滴10-50μl磷钨酸于铜网上负染5分钟，以80 KV电压在透射电子显微镜观察并拍照；

(3)免疫荧光：将2-10μL的CM-DIL染色试剂加入到100μL的外泌体悬液中，室温下孵育10-30min；经离心、再标记、Fibronectin包被、爬片、清洗、固定后使用荧光共聚焦显微镜观察标本染色情况并拍照；

(4)裸鼠皮下移植瘤模型：使用无菌注射器吸取一定体积的细胞悬液，然后将10-200μL细胞悬液注射于裸鼠腋窝皮下，75％酒精棉签擦拭针孔处渗液；待实验终点所有裸鼠经5％水合氯醛麻醉后脱颈处死，剪刀剥离皮下肿瘤，测量肿瘤体积、天平称重，组织经多聚甲醛固定后备用，制得天然纳米囊泡。

9.根据权利要求8所述的天然纳米囊泡的制备方法，其特征在于：在步骤(1)中，Exoquick TM Kit(System Biosciences，USA)方法的步骤如下：50-500μl血清经1000-5000g离心10-30分钟去除细胞及碎片，上清移至另一洁净灭菌管中，加入Exoquick TM Kit试剂20-100μl上下颠倒混匀，4℃孵育，1500g离心10-30分钟，管底可见米白色沉淀，去除上清并再次1500g离心5-30分钟，小心去除上清液体，根据后续用途用PBS缓冲液或RNA裂解液重悬沉淀。提取所得沉淀按先前文献描述方法进行透射电镜观察。

10.一种由权利要求8或9所述的方法制得的天然纳米囊泡。